一种小花清风藤的HPLC指纹图谱建立方法与流程

本发明涉及一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法，属于药品技术的领域。
背景技术：
：中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。小花清风藤sabiaparviflorawall.exroxb.为清风藤科sabiaceae清风藤属sabia植物，是贵州苗族、布依族等民族治疗肝炎、风湿痹痛、跌打损伤等疾病的常用药物。现代研究表明，小花清风藤及同属多种植物主要含生物碱类、黄酮类及三萜类成分，具有很好的抗病毒、保肝、降酶、抗炎等作用。近年来，作者在国家自然科学基金、贵州省一流学科建设等项目的资助下对小花清风藤及其同属植物开展了包括资源调查、引种栽培、生药鉴定、药材质量、化学成分、药理药效等方面的深入研究，发现小花清风藤具有较高的开发利用价值，但质量控制方面的研究还比较薄弱。鉴于中药指纹图谱在质量控制和鉴定方面具有突出优势，作者团队在对清风藤属药用植物资源、化学成分等进行系统研究的基础上，对小花清风藤的化学指纹图谱进行了深入研究，研究成果即为本发明。技术实现要素：本发明目的在于，提供一种小花清风藤药材的hplc指纹图谱建立方法。该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映小花清风藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的小花清风藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度和峰形好，柱效高。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法，包括以下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素-3-o-龙胆双糖苷、camellianoside、tsubakiosidea、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-芸香糖苷对照品，加70％乙醇溶液溶解，摇匀，制成槲皮素-3-o-龙胆双糖苷质量浓度为0.0625mg/ml、camellianoside质量浓度为0.250mg/ml、tsubakiosidea质量浓度为0.0675mg/ml、山奈酚-3-o-芸香糖苷质量浓度为0.0625mg/ml、异鼠李素-3-o-芸香糖苷质量浓度为0.0500mg/ml的混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：精密称定小花清风藤粉末1g，精密加70％乙醇溶液溶解，称定重量，超声提取，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得；(3)指纹图谱建立的色谱条件：色谱柱：thermoaccucore-c18，150×4.6mm，2.6μm；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液为a相，乙腈为b相，0.1％磷酸水溶液为c相；梯度洗脱，检测波长为360nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样量10μl；记录谱图得到小花清风藤药材的hplc指纹图谱；(4)标准指纹谱图的确认：按照上述提供的方法，对多批次小花清风藤建立其hplc指纹图谱，通过分析比较确定了15个共有峰，这些共有峰构成了小花清风藤的指纹特征，建立了共有模式，作为小花清风藤药材的标准指纹图谱。前述的小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法中，所述供试品溶液这样制备：精密称定小花清风藤粉末1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15ml，称定重量，超声提取60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。前述的小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法中，超声提取时，功率为100w，频率为80hz。前述的小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法中，梯度洗脱时，梯度洗脱程序是：0-5min：5％→12％的a和3％→6％的b；5-15min：12％→10％的a和6％→8％的b；15-20min：10％→20％的a和8％→10％的b；20-35min：20％→53％的a和10％→28％的b；35-45min：53％的a和28％的b；45-50min：53％→70％的a和28％→30％的b；50-60min：70％→65％的a和30％→35％的b。前述的小花清风藤药材的hplc指纹图谱建立方法中，所述15个共有峰中，1号峰为槲皮素-3-o-龙胆双糖苷，2号峰为camellianoside，3号峰为tsubakiosidea，4号峰为山奈酚-3-o-芸香糖苷，6号峰为异鼠李素-3-o-芸香糖苷。前述的小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法中，所述15个共有峰，以6号峰异鼠李素-3-o-芸香糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.444-0.447、0.515-0.518、0.714-0.719、0.831-0.833、0.943-0.945、1.000、1.107-1.117、1.551-1.557、1.629-1.635、1.646-1.653、1.664-1.671、1.776-1.784、1.804-1.813、2.250-2.260、2.282-2.292。发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述检测方法的研究。实验例：小花清风藤的hplc指纹图谱研究1仪器与试药1.1仪器thermoultimate-3000型高效液相色谱仪，dad检测器(德国thermo公司)；ag135型电子天平(瑞士mettler-toledo公司)；kq-500de型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；thermohytimate-c18(150×4.6mm，2.6μm)。1.2试药甲醇(美国天地有限公司，色谱纯。国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙腈(美国天地有限公司，色谱纯)；四氢呋喃(天津市大茂化学试剂厂，色谱纯)；乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(重庆川东化工有限公司，分析纯)；甲酸(天津市科技化学试剂有限公司，分析纯)；实验用水为重蒸馏水。槲皮素-3-o-龙胆双糖苷，camellianoside，tsubakiosidea，山奈酚-3-o-芸香糖苷，异鼠李素-3-o-芸香糖苷，以上对照品均通过ods-a-hgc18反向层析柱以及ailgent1100型半制备液相等分离手技术，自行从小花清风藤茎和叶中分离的单体化合物，结合1h-nmr和13c-nmr等波谱数据鉴定各化合物结构，利用hplc峰面积归一化法计算，其质量分数均大于98％，可供含量测定对照品用。1.3供试品的来源实验用样品均由作者亲自采自于贵州、云南、广西等省区，并经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为清风藤科(sabiaceae)植物小花清风藤(sabiaparviflorawall.ex.roxb.)的叶，植物凭证标本保存于贵州中医药大学生药实验室。样品信息详见表1。表1小花清风藤样品来源信息2方法与结果2.1色谱条件的确定色谱柱：thermoaccucore-c18(150×4.6mm,2.6μm)；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10μl；流速1.0ml/min；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表2。表2流动相梯度洗脱程序2.2供试品溶液的制备取样品粉末约1g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15ml，称定重量，超声提取(功率100w、频率80hz)60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得。2.3对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素-3-o-龙胆双糖苷、camellianoside、tsubakiosidea、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-芸香糖苷对照品适量，加70％乙醇溶液溶解并定容刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.0625mg/ml、0.250mg/ml、0.0675mg/ml、0.0625mg/ml、0.0500mg/ml的混合对照品溶液。2.4方法学考察2.4.1专属性试验为了考察供试品溶液的提取溶剂和流动相的干扰情况，以提取溶剂70％乙醇溶液，按“2.1”项下色谱条件进行专属性试验测定，结果为采集的色谱图中无干扰溶剂峰出现，表明提取溶剂及流动相基本无干扰。(见图1)2.4.2完整性试验取s1药材(贵州省镇宁县)粉末约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。为考察采集指纹图谱的完整性，记录60min后，以30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液(65:35:0)流动相比例继续洗脱至120min，结果为色谱图中60min后无色谱峰信息，表明采集60min色谱图即可完整记录小花清风藤的化学成分信息。(见图2)2.4.3精密度试验取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样六次，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-o-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(1号)、camellianoside(2号)、tsubakiosidea(3号)和山奈酚-3-o-芸香糖苷(4号)的相对保留时间的rsd值分别为0.16％、0.16％、0.28％、0.083％；相对峰面积的rsd值分别为0.54％、1.19％、0.50％、0.45％；均小于2.0％，结果表明仪器精密度良好。(见表3，图3)表3精密度实验结果2.4.4重复性试验取s1药材(贵州省镇宁县)粉末6份，每份约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-o-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(1号)、camellianoside(2号)、tsubakiosidea(3号)和山奈酚-3-o-芸香糖苷(4号)的保留时间的rsd值分别为0.084％、0086％、0.038％、0.079％；相对峰面积的rsd值分别为1.0％、0.63％、0.77％、1.9％；均小于2.0％，表明该方法重复性良好。(见表4，图4)表4重复性试验结果2.4.5稳定性试验取s1药材(贵州省镇宁县)粉末，约1g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24h依法测定，记录保留时间及峰面积。以异鼠李素-3-o-芸香糖苷(6号)为参照，槲皮素-3-o-龙胆双糖苷(1号)、camellianoside(2号)、tsubakiosidea(3号)和山奈酚-3-o-芸香糖苷(4号)的保留时间的rsd值分别为0.065％、0.077％、0.047％、0.030％；相对峰面积的rsd值分别为0.92％、0.55％、0.32％、1.6％；均小于2.0％，结果表明供试品溶液在24h内保持稳定。(见表5，图5)表5稳定性试验结果2.5指纹图谱的建立与相似度评价2.5.1指纹图谱的建立将11批小花清风藤药材粉末分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录60min的色谱。对比色谱图共得到15个共有峰；记录其保留时间和共有峰峰面积，见表6和表8；其中供试品溶液中1、2、3、4、6号峰与混合对照品比对归属为槲皮素-3-o-龙胆双糖苷、camellianoside、tsubakiosidea、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-芸香糖苷，以6号峰异鼠李素-3-o-芸香糖苷作为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值，结果表明，各共有指纹峰相对保留时间、峰面积比值相对稳定，见表7和表9，符合中药指纹图谱的技术要求。表611批小花清风藤药材叶的15个特征峰的保留时间(min)序号f1f2f3f4f5f6(s)f7f8f9f10f11f12f13f14f15s110.43012.10716.81719.48322.09023.38026.10336.36038.18738.60039.02041.64042.31052.74753.507s210.39012.09016.76319.44322.08023.38026.07736.36338.20038.60739.02341.67342.33752.75753.510s310.43312.10016.77719.45322.06723.39326.08036.34738.18038.58339.00041.62742.28052.74053.497s410.42012.09016.78019.44722.06323.36026.08336.34338.15738.58039.00341.61042.28352.76053.507s510.43712.01716.68019.39022.04723.34726.06036.35038.17038.59339.01341.64342.31752.76053.510s610.44312.13316.84719.51722.11023.43325.93336.34338.17738.57738.99041.61742.27052.72053.467s710.43812.10716.81719.48722.09023.40026.09736.34038.18338.56738.97741.59742.24352.71753.467s810.44312.04316.73319.44322.06023.36726.08336.32738.15038.55038.96341.56742.22352.72053.467s910.44012.08716.78319.46322.07323.36726.09336.33338.16038.56038.97341.58342.23752.71353.463s1010.44312.06316.76719.45722.06723.36326.08736.32338.14338.55038.96741.56742.22752.71753.463s1110.44312.05316.72019.43022.06323.38326.07336.32738.15338.55338.96741.57342.22752.71753.463表711批小花清风藤药材叶的15个特征峰的相对保留时间序号f1f2f3f4f5f6(s)f7f8f9f10f11f12f13f14f15s10.4460.5180.7190.8330.9451.0001.1161.5551.6331.6511.6691.7811.8102.2562.289s20.4440.5170.7170.8320.9441.0001.1151.5551.6341.6511.6691.7821.8112.2572.289s30.4460.5170.7170.8320.9431.0001.1151.5541.6321.6491.6671.7791.8072.2552.287s40.4460.5180.7180.8320.9441.0001.1171.5561.6331.6521.6701.7811.8102.2592.291s50.4470.5150.7140.8310.9441.0001.1161.5571.6351.6531.6711.7841.8132.2602.292s60.4460.5180.7190.8330.9441.0001.1071.5511.6291.6461.6641.7761.8042.2502.282s70.4460.5170.7190.8330.9441.0001.1151.5531.6321.6481.6661.7781.8052.2532.285s80.4470.5150.7160.8320.9441.0001.1161.5551.6331.6501.6671.7791.8072.2562.288s90.4470.5170.7180.8330.9451.0001.1171.5551.6331.6501.6681.7801.8082.2562.288s100.4470.5160.7180.8330.9451.0001.1171.5551.6331.6501.6681.7791.8072.2562.288s110.4470.5150.7150.8310.9441.0001.1151.5541.6321.6491.6661.7781.8062.2552.286平均值0.4460.5170.7170.8320.9441.0001.1151.551.6331.6501.671.781.8082.2562.288rsd/％0.200.230.230.0950.06400250.100.0920.120.120.120.150.120.12表811批小花清风藤药材叶的15个特征峰的峰面积结果序号f1f2f3f4f5f6(s)f7f8f9f10f11f12f13f14f15s122.668181.401933.60466.365216.213517.35743.11951.50312.46768.14781.119112.85121.43582.44924.4361s25.137914.54979.54788.40825.95684.51980.44552.29734.317915.12761.726127.9482241994.56208.3865s30.723625.399212.28836.73807.96135.27831.63782.74934.566117.89881.949830.40722.42742.81444.4816s41.525633.51665.32140.84437.00142.19801.23360.30220.60112.37210.35074.69800.48966.488727.8631s51.828149.499217.61733.02604.69721.67803.03430.44530.81112.58290.36984.65000.51934.084413.1361s615.821463.713938.53959.07257.593813.84952.79542.57374.058815.38622.015523.68983.54741.00081.0774s76.234537.392311.53353.589313.85558.16302.19104.36587.341022.14623.097332.15584.33560.43300.3257s84.501562.266716.18341.668113.09427.72430.44241.71863.148210.00921.393417.37112.62741.73911.6520s99.645544.991115.37604.84788.605610.51381.55222.03133.599911.97231.665319.68692.86700.95191.3684s103.630156.218017.59438.84284.54524.00783.29340.93611.91845.12640.74129.66211.49461.54101.9348s116.561030.36226.55686.16797.46846.94281.46851.84453.108011.73351.662819.42442.75881.71752.3523表911批小花清风藤药材叶的15个特征峰的峰面积比值序号f1f2f3f4f5f6(s)f7f8f9f10f11f12f13f14f15s11.3054.6901.9360.3670.9341.0000.1800.0870.1420.4690.0640.7400.0830.1410.256s21.1373.2192.1121.8601.3181.0000.0990.5080.9553.3470.3826.1840.5351.0091.856s30.1374.8122.3281.2771.5081.0000.3100.5210.8653.3910.3695.7610.4600.5330.849s40.74015.2492.4210.3843.1851.0000.5610.1370.2731.0790.1602.1370.2232.95212.677\s51.08929.49910.4991.8032.7991.0001.8080.2650.4831.5390.2202.7710.3092.4347.828s61.1424.6002.7830.6550.5481.0000.2020.1860.2931.1110.1461.7110.2560.0720.078s70.7644.5811.4130.4401.6971.0000.2680.5350.8992.7130.3793.9390.5310.0530.040s80.5838.0612.0950.2161.6951.0000.0570.2220.4081.2960.1802.2490.3400.2250.214s90.9174.2791.4620.4610.8191.0000.1480.1930.3421.1390.1581.8720.2730.0910.130s100.90614.0274.3902.2061.1341.0000.8220.2340.4791.2790.1852.4110.3730.3850.483s110.9454.3730.9440.8881.0761.0000.2120.2660.4481.6900.2392.7990.3970.2470.339平均值0.8798.8542.9440.9601.5191.0030.4240.2870.5081.8580.2262.9610.3440.7402.25rsd/％36.790.290.173.953.60120.255.754.249.947.356.939.6136.5183.82.5.2相似度评价结果将11批小花清风藤药材的hplc图谱导入指纹图谱软件(2004a版)，设定s1为参照谱，采用多点校正，时间窗宽度为0.5，对照图谱生成方法为中位数法，建立指纹图谱见图6，生成的共有峰对照图谱见图7，5个特征成分的紫外吸收光谱图见8。相似度计算评价结果表明，各产地小花清风藤药材的指纹图谱相似度计算结果除了s9、s10和s11外，其他批次的指纹图谱相似度在0.80以上，说明不同产地的小花清风藤药材化学成分相对较一致，结果见表10。表10相似度评价结果2.6化学计量分析仅从相似度差别上很难全面反应映不同批样品间的异同。故进一步采用spss16.0软件对不同批次小花清风藤药材指纹图谱的共有峰数据进行聚类分析(hca)和主成分分析(pca)。2.6.1聚类分析(hca)采用spss16.0统计分析软件，以系统聚类法中的组间距离法、矢量余弦距离作为样品测度，对11批次小花清风藤药材的各峰面积标准化数据进行聚类分析，并绘制树状图，见图9。当判别条件距离为20时，大致分为三大类，ⅰ类包括s4，s5，s10；ⅱ类包括s1，s6；ⅲ类包括s2，s3，s7，s8，s9，s11。当判别条件距离为5时，可分为九大类：云南省罗平县(s10)、贵州省镇宁县(s1)、贵州省兴义市(s11)、贵州省安龙县(s7)、广西省西林县(s9)、云南省师宗县(s8)的样品单独聚为一类，广西省田林县(s2)和贵州中医药大学引种(s3)号样品聚为一类，可见云、贵、广三省由于地势地貌、海拔气候等多个环境因素的影响，导致药材内在化学成分含量存在区别；贵州省册亨县坡妹镇(s6)单独聚为一类，s4与s5为贵州省册亨县的邻镇聚为一类，可见即便是同一产地也有个别批次药材质量存在差异；各批次样品之间的相关性与相似度分析结果较为一致。2.6.2主成分分析(pca)为了更直接地评价15个共有成分对样品的分辨能力，以主成分的特征根和贡献率作为选择主成分的依据，采用spss16.0版软件对11批小花清风藤药材样品进行pca分析，求出相关矩阵的特征值及其方差，见表11。以特征值＞1为提取标准，得到前3个因子的累计方差贡献率为87.375％。pca碎石图见图10，率先提取出来的3个因子的坡度较为陡峭而后续形成的坡度较为平缓，故选择这3个因子为主要成分1、2、3。主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向。除了共有峰f7、f14、f15对主成分1成负相关，其余的均正相关，其中以f8～f13的贡献最大；共有峰f1～f7对主成分2成正相关，共有峰f8～f15对主成分2成负相关，其中f1～f3、f6和f7对主成分2贡献最大；除f3、f4、f7、f10和f12对主成分3成负相关，其余的均正相关，f5对主成分3的贡献最大，见表12。表11特征值与方差贡献率表12主成分载荷矩阵对上述主成分载荷值进行计算，得出各主成分的线性模型：其中，z1、z2、z3分别表示第1、2、3个主成分，z代表结合3个主成分得到的综合主成分，x1～x15分别表示15个共有峰峰面积的标准化数据。将各样本数据代入上述模型后，得到各批次样本的主成分得分，见表13；s1的综合得分最高，质量最好，其次是s6和s7号批样品；并以样品的第1、2、3主成分得分做三维散点图，见图11，11批样品的分类结果与hca结果较为一致。z1＝0.404x1+0.290x2+0.284x3+0.394x4+0.506x5+0.596x6-0.030x7+0.938x8+0.926x9+0.920x10+0.949x11+0.876x12+0.942x13-0.779x14-0.80x15；z2＝0.798x1+0.940x2+0.867x3+0.220x4+0.349x5+0.706x6+0.690x7-0.275x8-0.323x9-0.346x10-0.277x11-0.415x12-0.186x13-0.298x14-0.231x15；z3＝0.135x1+0.183x2-0.140x3-0.791x4+0.740x5+0.216x6-0.412x7+0.054x8+0.047x9-0.017x10+0.054x11-0.069x12+0.110x13+0.138x14+0.244x15；z＝1.337x1+1.413x2+1.011x3-0.177x4+1.595x5+1.518x6+0.248x7+0.717x8+0.650x9+0.557x10+0.726x11+0.329x12+0.866x13-0.939x14-0.787x15表13样本主成分得分3结论本实验采用二极管阵列检测器，分别考察了220nm、254nm、270nm、360nm的检测波长，结果表明在360nm波长下能较好反映各成分的紫外吸收，色谱信息丰富且基线平稳，因此选择360nm；对色谱柱phenomenexsynergihydro-rp80a(250×4.6mm，5μm)、phenomenexkinetex-c18(100×4.6mm，2.6μm)、thermoaccucore-c18(150×4.6mm，2.6μm)、thermohyperil(250×4.6mm，5μm)进行分析比较，测定结果表明，thermoaccucore-c18(150×4.6mm，2.6μm)色谱柱较其他三种色谱柱出峰较多，且分离度较好，故选择该柱进行指纹图谱分析；在流动相上分别对甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.1％冰乙酸水、甲醇-乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-乙腈-0.1％甲酸水、四氢呋喃-水、5％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、甲醇-5％四氢呋喃乙腈溶液-0.1％磷酸水溶液、10％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、20％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液、40％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液等14种流动相系统梯度洗脱分离情况进行试验比较，结果表明使用30％四氢呋喃甲醇溶液-乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相时色谱峰分离效果最好，大部分色谱峰达到基线分离，且各色谱峰纯度较高；分别设置柱温为25℃、30℃和35℃，比较其分离效果，结果表明柱温为30℃时分离效果和色谱峰的对称性较好，故选择30℃。本实验对提取方法(超声、回流、冷浸)，提取溶剂(甲醇、乙醇)，提取溶剂的比例(50％、60％、70％、80％、90％)，料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)进行考察，综上确定“2.2”项供试品溶液的制备。本发明建立5个黄酮类化学成分的小花清风藤药材指纹图谱鉴别方法，可较全面地反映该药材的内在品质。通过对得到的15个共有色谱峰依次运用相似度分析、聚类分析和主成分分析3种方法较全面地进行分析，结果显示样品间的共有峰相对保留时间差异较小，但峰面积却存在一定差异，表明不同产地小花清风藤药材所含化学成分较为一致；本发明为小花清风藤药材的质量评价建立了一套较为完善的科学体系，可作为小花清风藤药材基源鉴定和质量控制的科学依据。以上试验表明，该建立的方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，本发明为完善小花清风藤药材的质量评价体系、药材基源鉴定和质量控制的提供了科学依据。与现有技术相比，该方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；用该方法还能较为全面地反映小花清风藤中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。且用该方法检测到的小花清风藤指纹图谱化学成分相对较多、各特征峰高度比例适中，基线较平稳，分离度和峰形好，柱效高。附图说明图1是专属性试验hplc色谱叠加图；其中，a-70％乙醇溶液；b-混合对照品溶液；c-供试品溶液；图2是完整性试验hplc色谱叠加图；图3是精密度试验hplc色谱叠加图；图4是重复性试验hplc色谱叠加图；图5是稳定性试验hplc色谱叠加图；图6是11批小花清风藤药材hplc共有模式叠加图(时间窗宽度为0.5，中位数法)；图7是小花清风藤药材hplc对照指纹图谱；ⅰ-混合对照品图谱；ⅱ-共有峰对照指纹图谱；1-槲皮素-3-o-龙胆双糖苷；2-camellianoside；3-tsubakiosidea；4-山奈酚-3-o-芸香糖苷；6-异鼠李素-3-o-芸香糖苷；图8是供试品与混合对照溶液的紫外吸收光谱图；图9是11批小花清风藤药材聚类分析树状图；图10是主成分碎石图；图11是11批小花清风藤药材主成分得分图。下面结合实施例对本发明作进一步的说明。具体实施方式实施例：一种小花清风藤的hplc指纹图谱建立方法，包括以下步骤：(1)混合对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素-3-o-龙胆双糖苷、camellianoside、tsubakiosidea、山奈酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-芸香糖苷对照品，加70％乙醇溶液溶解，摇匀，制成槲皮素-3-o-龙胆双糖苷质量浓度为0.0625mg/ml、camellianoside质量浓度为0.250mg/ml、tsubakiosidea质量浓度为0.0675mg/ml、山奈酚-3-o-芸香糖苷质量浓度为0.0625mg/ml、异鼠李素-3-o-芸香糖苷质量浓度为0.0500mg/ml的混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：精密称定小花清风藤粉末1g，置50ml具塞锥形瓶中，精密加70％乙醇溶液15ml，称定重量，在功率为100w，频率为80hz条件下超声提取60min，放冷，用70％乙醇溶液补重，摇匀，过滤，滤液用0.45μm有机微孔滤膜过滤，即得；(3)指纹图谱建立的色谱条件：色谱柱：thermoaccucore-c18，150×4.6mm，2.6μm；流动相：30％四氢呋喃甲醇溶液为a相，乙腈为b相，0.1％磷酸水溶液为c相；梯度洗脱，检测波长为360nm，流速为1ml/min，柱温30℃，进样量10μl；记录谱图得到小花清风藤药材的hplc指纹图谱；梯度洗脱程序：0-5min：a(5％→12％)和b(3％→6％)；5-15min：a(12％→10％)和b(6％→8％)；15-20min：a(10％→20％)和b(8％→10％)；20-35min：a(20％→53％)和b(10％→28％)；35-45min：a(53％)和b(28％)；45-50min：a(53％→70％)和b(28％→30％)；50-60min：a(70％→65％)和b(30％→35％)。所述15个共有峰中，1号峰为槲皮素-3-o-龙胆双糖苷，2号峰为camellianoside，3号峰为tsubakiosidea，4号峰为山奈酚-3-o-芸香糖苷，6号峰为异鼠李素-3-o-芸香糖苷；所述15个共有峰，以6号峰异鼠李素-3-o-芸香糖苷为参照峰，其相对保留时间分别为0.444-0.447、0.515-0.518、0.714-0.719、0.831-0.833、0.943-0.945、1.000、1.107-1.117、1.551-1.557、1.629-1.635、1.646-1.653、1.664-1.671、1.776-1.784、1.804-1.813、2.250-2.260、2.282-2.292。当前第1页12