一种快速检测白细胞毒素的方法与流程

本发明涉及食品安全技术领域，具体涉及一种快速检测白细胞毒素的方法。

背景技术：

9，10-环氧-12-亚油酸(9，10-epoxy-12-linoleicacid)，又名白细胞毒素(leukotoxin，ltx)，是由亚油酸通过自动氧化，或者在细胞色素p450(cytochromep450)的作用下环氧化而成的一种衍生物。在生物体内，ltx可溶性环氧化物水解酶(solubleepoxidehydrolase，seh)的共同存在可以促成其转化为9，10-二羟基-十八碳烯酸(9，10-dihydroxyoctadecenicacid)，取名为白细胞毒素二醇(leukotoxindiol，ltxd)。白细胞毒素二醇为白细胞毒素开环形成频哪醇的化合物。大量研究已经证实ltx和ltxd与烧伤病人多器官功能衰竭、急性呼吸窘迫征、线粒体解偶联以及人乳腺癌细胞增殖等众多现象相关，但这些研究都是基于体外培养、静脉注射或者自身产生，而对ltxs及iltxds的口服急性毒性研究的文献还比较少见。

近年来，随着大量ltxs和ltxds在食品中的新发现不断被提出，它们在加工食品中含量水平如何，以及潜在的毒性危害有多大等问题已引起了广泛关注。由于白细胞毒素在食品中主要是以三酰甘油形式存在，所以目前国内外对白细胞毒素和白细胞毒素二醇的检测也主要是基于衍生化(皂化、甲酯化)反应，通过gc-ms或gc-fid等技术进行检测。但是ltx不能直接进行gc-ms分析，必须经过复杂、繁琐的衍生反应，且衍生化反应需要无水，操作要求较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对上述ltx不能直接进行gc-ms分析，必须经过复杂、繁琐的衍生反应，且衍生化反应需要无水的现象导致操作要求较高，检测方法复杂的问题，本发明提供一种快速检测白细胞毒素的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测白细胞毒素的方法，包括如下步骤：

步骤1：对照样品的准备：制备白细胞毒素溶液，对白细胞毒素溶液进行分离纯化，得到高纯度白细胞毒素对照样品，白细胞毒素溶液制备方法为：将重量份为5份的亚油酸，加入到圆底烧瓶中，加入400份干燥二氯甲烷和磁子，并将圆底烧瓶放入装满冰的冰槽中。另外将重量份为3份的3-氯过氧苯甲酸，溶于50份干燥二氯甲烷中。将含有3-氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液通过恒压分液漏斗缓慢滴加至圆底烧瓶中，滴加时间约持续3min，并在磁子搅拌下，在冰槽中持续反应6h，每隔半小时通过薄层层析(tlc)方法检测进程。待反应完成，加入50份水中断反应，转入分液漏斗，对反应混合物进行洗涤。将混合物倒入分液漏斗，加入50份10％碳酸氢钠水溶液，充分震荡后分去上层。再用4％nacl水溶液洗一次，最后用纯水洗三次，加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤掉无水硫酸钠后，在旋蒸仪中以36℃水浴减压蒸干，-20℃冷冻保存；

步骤2：质谱条件：watersxevog2qtof系统，采用esi离子源负离子模式，分辨模式，用甲酸钠矫正质量轴，用亮氨酸脑啡肽，作为标准物质进行实时矫正，氩气作为碰撞气体，碰撞梯度1.9，毛细管电压2.5kv，脱溶剂温度350-450℃，脱溶剂气流量500-700l/hr，离子源温度100-140℃；

步骤3：色谱条件：采用acquity-uplc-behc18，2.1×100mm，1.7μm的色谱柱，柱温：30-50℃，以0.1％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱的方式为：0-2min，25％流动相a；2-6min，25-15％流动相a；6-8min，15-10％流动相a；8-8.5min，10-25％流动相a；8.5-10min，25％流动相a；流速0.1-0.3ml/min。

步骤4：用乙腈将食品样品溶解，过滤后注入进样瓶，然后将对照样品和样瓶中的食品样品均进行uplc-qtofms(超高压液相色谱-飞行时间质谱仪)检测。

进一步，所述步骤1中通过硅胶柱层析的方法分离纯化白细胞毒素。

进一步，所述步骤1中通过高效液相色谱的方法分离纯化白细胞毒素。

进一步，所述步骤1中对照样品设置为白细胞毒素二醇，先制备白细胞毒素二醇溶液，然后通过制备薄层色谱的方法分离纯化白细胞毒素二醇，得到高纯度白细胞毒素二醇对照样品，白细胞毒素二醇溶液制作方法为：按照thf∶h2o∶5％hclo4＝5∶1∶1的比例配置溶剂，分别量取thf300份，超纯水60份，和5％的hclo460份，作为溶剂，混合均匀备用。取转子放入锥形瓶，并加入300份现配溶剂，取分离纯化后的白细胞毒素溶液4份溶于溶剂中，保持转子搅拌，在室温下连续反应2个小时，期间使用tlc方法检测反应进度，反应结束后用甲醇涮洗至蒸馏瓶，在36℃水浴下减压蒸馏至蒸馏速率变缓，停止蒸馏。将蒸馏余液倒入分液漏斗，用适量乙醚萃取三次，取上层液入蒸馏瓶继续在36℃水浴下减压蒸馏，至粥样状态转移至氮吹30min，于-20℃保存

进一步，所述步骤3中梯度洗脱的方式为：0-2min，60％流动相a；2-6min，60-20％流动相a；6-8min，20-10％流动相a；8-10min，10-10％流动相a；10-10.2min，10-60％流动相a。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1.通过uplc-qtofms进行检测，同时对检测条件进行了优化，在保证检测准确度和加样回收率的同时，省去了复杂的衍生化反应，使食品中白细胞毒素及其二醇的检测更加简便。

2.通过调整流动相的比例和洗脱梯度，增加水的比例，使其流动相极性增强，洗脱能力减弱，才能使被测物保留时间增长，出峰时间后移。

3.通过优化色谱条件，可以实现白细胞毒素及其异构体、白细胞毒素二醇及其异构体四种化合物的快速分离与精确检测。

附图说明

本实用发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1是本发明对照样品uplc-qtofms分析谱图；

图2是本发明对照样品制备薄层色谱分离前样品做uplc-qtofms分析谱图；

图3是本发明质谱1号峰解析谱图；

图4是本发明质谱2号峰解析谱图；

图5是本发明质谱3号峰解析谱图；

图6是本发明质谱4号峰解析谱图；

图7是本发明ltx的裂解图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

下面结合图1和图2对本发明作详细说明。

实施例1

一种快速检测白细胞毒素的方法，包括如下步骤：

步骤1：对照样品的准备：制备白细胞毒素溶液，通过高效液相色谱的方法分离纯化白细胞毒素，得到高纯度白细胞毒素对照样品；

步骤2：质谱条件：watersxevog2qtof系统，采用esi离子源负离子模式，分辨模式。用甲酸钠矫正质量轴，用亮氨酸脑啡肽，m-h＝554.2612，作为标准物质进行实时矫正，氩气作为碰撞气体，碰撞梯度1.9，毛细管电压2.5kv，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气流量500l/hr，离子源温度100℃；

步骤3：色谱条件：采用acquity-uplc-behc18，2.1×100mm，1.7μm的色谱柱，柱温：30℃，以0.1％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱的方式为：0-2min，25％流动相a；2-6min，25-15％流动相a；6-8min，15-10％流动相a；8-8.5min，10-25％流动相a；8.5-10min，25％流动相a；流速0.1ml/min。

步骤4：用乙腈将食品样品溶解，过滤后注入进样瓶，然后将对照样品和样瓶中的食品样品均进行uplc-qtofms检测。

由图1可见，出峰时间：t＝2.39(1号峰代表物质为异白细胞毒素iltx)及t＝2.49(2号峰物质为白细胞毒素ltx)，食品样品出峰时间与对照样品出峰时间基本一致。

实施例2

一种快速检测白细胞毒素的方法，包括如下步骤：

步骤1：对照样品的准备：制备白细胞毒素溶液，通过硅胶柱层析的方法分离纯化白细胞毒素，得到高纯度白细胞毒素对照样品；

步骤2：质谱条件：watersxevog2qtof系统，采用esi离子源负离子模式，分辨模式。用甲酸钠矫正质量轴，用亮氨酸脑啡肽，m-h＝554.2612，作为标准物质进行实时矫正，氩气作为碰撞气体，碰撞梯度1.9，毛细管电压2.5kv，脱溶剂温度400℃，脱溶剂气流量600l/hr，离子源温度120℃；

步骤3：色谱条件：采用acquity-uplc-behc18，2.1×100mm，1.7μm的色谱柱，柱温：40℃，以0.1％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱的方式为：0-2min，60％流动相a；2-6min，60-20％流动相a；6-8min，20-10％流动相a；8-10min，10-10％流动相a；10-10.2min，10-60％流动相a；流速0.2ml/min。

步骤4：用乙腈将食品样品溶解，过滤后注入进样瓶，然后将对照样品和样瓶中的食品样品均进行uplc-qtofms检测。

食品样品出峰时间与对照样品出峰时间基本一致。

实施例3

一种快速检测白细胞毒素的方法，包括如下步骤：

步骤1：对照样品的准备：制备白细胞毒素二醇溶液，通过制备薄层色谱方法分离纯化白细胞毒素二醇，得到高纯度白细胞毒素二醇对照样品；

步骤2：质谱条件：watersxevog2qtof系统，采用esi离子源负离子模式，分辨模式。用甲酸钠矫正质量轴，用le，亮氨酸脑啡肽，m-h＝554.2612，作为标准物质进行实时矫正，氩气作为碰撞气体，碰撞梯度1.9，毛细管电压2.5kv，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量700l/hr，离子源温度140℃；

步骤3：色谱条件：采用acquity-uplc-behc18，2.1×100mm，1.7μm的色谱柱，柱温：50℃，0.1％甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱的方式为：0-2min，60％流动相a；2-6min，60-20％流动相a；6-8min，20-10％流动相a；8-10min，10-10％流动相a；10-10.2min，10-60％流动相a；流速0.3ml/min。

步骤4：用乙腈将食品样品溶解，过滤后注入进样瓶，然后将对照样品和样瓶中的食品样品均进行uplc-qtofms检测。

由图2可见，三号峰表示异白细胞毒素二醇iltxd，四号峰表示白细胞毒素二醇ltxd，食品样品出峰时间与对照样品出峰时间基本一致。