一种血浆中左氧氟沙星的定量检测方法与流程

本发明属于左氧氟沙星检测
技术领域：
，具体涉及一种血浆中左氧氟沙星的定量检测方法。
背景技术：
：左氧氟沙星是第3代氟喹诺酮类药物，对革兰阳性菌有广谱杀菌作用，且抗菌作用强、作用持久，适用于治疗敏感格兰阴性菌和革兰阳性菌引起的呼吸系统、泌尿系统、消化系统、皮肤软组织感染等。而氧氟沙星的右旋异构体几乎没有抗菌作用，并且其毒性大于左旋异构体。因此左氟氧沙星在临床上得到了广泛应用，被美国fda批准用于治疗医院获得性肺炎。左氧氟沙星由日本第一制药株式会社1994年研制成功并在日本上市，1996年获得的fda批准，临床上用于治疗敏感菌引起的轻、中度感染，呼吸系统及泌尿生殖系统感染。因其疗效好、副作用小等优点，在临床上应用广泛，是国内使用较多的品种，市场需求量大。左氧氟沙星的检测方法对缩短左氧氟沙星一致性评价的研究周期和研究人血浆中左氧氟沙星的药代动力学特征是重要前提。然而，目前左氧氟沙星的检测方法，存在检测时间长、检测质量不稳定且进样量小等缺陷，严重影响左氧氟沙星一致性评价和人血浆中左氧氟沙星的药代动力学特征的进度，增加其用药难度和后续研究难度。因此，急需开发一种快速、灵敏、准确的左氧氟沙星的检测方法。技术实现要素：为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种血浆中左氧氟沙星的定量检测方法。本发明所采用的技术方案为：本发明提供了一种血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制：称取左氧氟沙星对照品至玻璃瓶中，加入甲醇，配制成浓度为1～10mg·ml-1的左氧氟沙星储备液，将所述左氧氟沙星储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成浓度为100～100000ng·ml-1的左氧氟沙星工作溶液；称取一定量的内标左氧氟沙星-d8至玻璃瓶中，加入甲醇配制成浓度为1～10mg·ml-1的内标储备液，用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释成800～1000ng·ml-1的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在-20℃下保存，备用；(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μl血浆样品，向样品中加入内标工作溶液和甲醇沉淀剂，进行lc-ms/ms分析；(3)标准曲线配制过程：取空白血浆，向其中加入步骤(1)中所述系列左氧氟沙星工作溶液，配制成系列校正标样及随行质控样品，然后分别注入lc-ms/ms中进行测定，以左氧氟沙星和内标左氧氟沙星-d8的色谱峰面积比为纵坐标，以血浆中左氧氟沙星的浓度为横坐标制作标准曲线；(4)lc-ms/ms测定过程：根据标准曲线计算血浆样品中的左氧氟沙星浓度。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述步骤(2)包括如下步骤：取20.0～60.0μl血浆样品，向样品中加入等量步骤(1)所述的内标工作溶液，然后加入8倍于血浆样品体积的甲醇沉淀剂，涡旋混合，于3～8℃的离心机中离心10～15分钟；取上清液并向上清液中加入4倍于上清液体积的纯化水，振荡混匀3～5分钟，进行lc-ms/ms分析。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中lc-ms/ms测定过程工作条件为：a.色谱条件：色谱柱为geminic18，5μm，2×50.0mm，phenomenex；流动相a：含0.1％甲酸和10mm乙酸铵的水溶液；流动相b：乙腈；柱温箱温度：30～50℃；流速：0.2～0.8ml/min；洗脱方式为梯度洗脱；b.质谱条件：离子源为esi源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：5000～6000v；涡旋离子喷雾温度：450～550℃；气帘气：30psi；碰撞池气体：6unit；雾化气：50psi；辅助气：55psi；数据收集时间：3～5min。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中lc-ms/ms测定过程中左氧氟沙星的监测离子对为362.2/318.2，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压80v，碰撞能量30ev。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述步骤(2)或步骤(3)中lc-ms/ms测定过程中内标左氧氟沙星-d8的监测离子对为370.2/326.3，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压63v，碰撞能量30ev。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述步骤(3)中随行质控样品包括hqc、mqc、gmqc和lqc，所述hqc、mqc、gmqc和lqc中左氧氟沙星的浓度分别依次为3750ng·ml-1、2500ng·ml-1、200ng·ml-1和15.0ng·ml-1。优选地，上述血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，所述色谱条件还包括：自动进样器清洗溶液为甲醇溶液，所述甲醇溶液的体积百分数为50％；自动进样器温度为4.0℃；自动进样器清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积为2000μl；自动进样器进样针清洗时浸泡时间为3s；自动进样器进样体积为5.0μl。优选地，所述步骤(1)中甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为1:1；所述步骤(2)中离心条件为4℃、4000rpm或2270×g离心10min。本发明的有益效果为：与现有技术相比，本发明提供的血浆中左氧氟沙星的定量检测方法具有以下优点：1、本发明提供的血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，采用多反应监测模式进行定性和定量，能够有效提高定性准确度和方法的灵敏度，最低检测限可达到纳克级水平，分析时间短，所需样品量更少；2、本发明提供的血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，在血浆样品中加入甲醇沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高；3、本发明提供的血浆中左氧氟沙星的定量检测方法，利用校正标样及随行质控样品确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性定量分析结果可靠。附图说明图1是本发明的比格犬血浆中左氧氟沙星浓度测定的代表性标准曲线。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。实施例：本实施例的目的在于提供一种血浆中左氧氟沙星的定量检测方法。1.实验耗材与仪器：分析天平：xp6百万分之一电子天平，mettlertoledo；离心机：5810r离心机，eppendorf；超声清洗器：kq-400de超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；移液器：0.5-10μl，2-20μl，20-200μl，100-1000μl，eppendorf；玻璃样品瓶及螺旋盖：1.5ml，4ml，10ml，100ml，500ml，1000ml及2000ml等，武汉宝因生物科技有限公司；96孔深孔板：dw-96-22-c，2.2ml，上海百赛生物技术股份有限公司；聚丙烯离心管：1.5ml，武汉宝因生物科技有限公司；高效液相色谱泵：lc-20ad，shimadzu公司；自动进样器：sil-20acmp，shimadzu公司；柱温箱：cto-20ac，shimadzu公司；质谱仪：api4000，absciex公司；2.血浆中左氧氟沙星浓度lc-ms/ms测定方法的建立：(1)标准工作溶液的配制：储备液的配制：分别精密称取两份一定量的左氧氟沙星对照品至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇，配制左氧氟沙星对照品的浓度为1.00mg·ml-1的储备液，标记为s01-1与s01-2；称取一定量的左氧氟沙星-d8(内标)至玻璃瓶中，精密加入一定体积的甲醇，配制成左氧氟沙星-d8的浓度为1.00mg·ml-1的内标储备液；所有储备液保存在-20℃冰箱中，备用。工作溶液的配制：将配制好的左氧氟沙星储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀释成浓度为100000、90000、60000、20000、5000、1000、200和100ng·ml-1的左氧氟沙星工作溶液，用于配制校正标样；将平行称量配制的另一份左氧氟沙星储备液逐级稀释成浓度为75000、50000、4000、300和100ng·ml-1的左氧氟沙星工作溶液，用于配制质控样品；用体积比为1:1的甲醇水溶液将左氧氟沙星-d8(内标)储备液稀释成800ng·ml-1的内标工作溶液；所有的工作溶液保存在-20℃冰箱中，备用。(2)血浆样品前处理过程：取20.0～60.0μl比格犬血浆样品，以50μl为例；取50μl比格犬血浆样品，加入50.0μl内标工作溶液，然后加入400μl甲醇沉淀剂，涡旋混合至少10分钟，样品于3～8℃的离心机中以4000rpm(2270×g)离心10～15分钟，优选为于4℃的离心机中以4000rpm(2270×g)离心10分钟。转移50.0μl上清液至另一干净的96孔板中，然后加入200μl纯化水，振荡混匀至少3分钟，进行lcms/ms分析。(3)标准曲线配制过程：取45.0μl步骤(1)所述左氧氟沙星工作溶液，加入到855μl空白血浆中，涡旋混匀，配制成5000、4500、3000、1000、250、50.0、10.0、和5.00ng·ml-1的校正标样，及3750ng·ml-1(hqc)、2500ng·ml-1(mqc)、200ng·ml-1(gmqc)和15.0ng·ml-1(lqc)的随行质控样品；将校正标样及随行质控样品，分别注入lc-ms/ms中进行测定。左氧氟沙星和内标左氧氟沙星-d8的色谱图采集和色谱峰积分由软件analyst1.6.3(absciex)进行处理，分别以左氧氟沙星和内标左氧氟沙星-d8的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法以比格犬血浆中左氧氟沙星的浓度(x)与峰面积比(y)进行线性回归，所得的回归方程(y＝a+bx)即为标准曲线，根据标准曲线计算比格犬血浆样品中的左氧氟沙星浓度。(4)lc-ms/ms测定过程工作条件为：a.色谱条件：色谱柱：geminic18，5μm，2×50.0mm，phenomenex；流动相a：含体积百分数为0.1％甲酸和10mm乙酸铵的水溶液；流动相b：含体积百分数为0.1％甲酸的乙腈；自动进样器清洗溶液：50％甲醇水溶液；柱温箱温度：40℃；流速：0.70ml/min；自动进样器温度：4.0℃；自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积：2000μl；自动进样器进样针清洗时浸泡时间：1s；自动进样器进样体积：200μl；洗脱梯度：洗脱梯度如表1所示。表1time(minute)modulefunctionvalue(％)0.00pumpspumpbconc.101.5pumpspumpbconc.301.6pumpspumpbconc.951.9pumpspumpbconc.952.0pumpspumpbconc.302.3pumpspumpbconc.952.5pumpspumpbconc.952.6pumpspumpbconc.104.0pumpspumpbconc.10b.质谱条件：离子化模式：正离子模式，electrosprayionization(esi)；扫描模式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压：5500v；涡旋离子喷雾温度：500℃；气帘气种类：氮气，设置为30psi；碰撞池气体种类：氮气，设置为6unit；雾化气种类：氮气，设置为50psi；辅助气种类：氮气，设置为55psi；数据收集时间：4.0min。分析物和内标的监测离子对、停留时间、去簇电压和碰撞能量参数见表2。表2*注明：停留时间，此处指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。(5)分析结果：进样原始结果见表3，以左氧氟沙星和左氧氟沙星-d8的峰面积比(analytearea/isarea)为纵坐标，比格血浆中左氧氟沙星(analyteconc./isconc.)的浓度(ng·ml-1)为横坐标进行线性回归。左氧氟沙星的代表性标准曲线y＝0.000767x+0.000304(r＝0.9987)，结果如图1所示。由图1可知，左氧氟沙星在5.00～5000ng·ml-1范围内线性良好。表3图1中八个校正标样对应的坐标点的数据注：每个标曲样品浓度设置两个2个平行样品；效果例本应用例的目的在于对上述实施例中lc-ms/ms方法测定血浆中左氧氟沙星浓度的准确度、精密度进行评价。取100μl上述hqc、mqc、gmqc、lqc四个浓度的质控样品各一份，按上述方法操作，于1日内进行lc-ms/ms测定，每个浓度6个样品重复测定6次，计算精密度，计算公式：准确度％＝(同浓度6个测定值的平均值-理论值)/理论值*100％；精密度％＝同浓度6个测定值的标准偏差/同浓度6个测定值的平均值*100％，结果如下表所示：表4本发明血浆中左氧氟沙星的定量检测方法各项指标均符合生物样品分析测定要求，采用本发明能够高效、严谨、便捷、准确的进行样品分析，获得相应的pk参数，缩短左氧氟沙星一致性评价的研究周期，研究左氧氟沙星的药代动力学特征，利于制药企业开展对左氧氟沙星的研究，使老百姓吃到安全、有效又便宜的药。本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。当前第1页12