本发明提供了一种基于磺酸化聚苯胺修饰的纳米纤维膜萃取动物源性食品中氟喹诺酮抗生素的方法。属于分析化学中的样品预处理技术领域。
背景技术：
氟喹诺酮(fqs)是一类人工合成抗菌药物，被广泛应用于畜牧和水产养殖业。由于fqs可导致致病菌耐药性和潜在致癌性，其在动物源性食品(水产品、禽畜肉及内脏、蛋、奶以及它们的加工产品)中的残留问题引起广泛关注。为保障食品安全，欧盟、世界卫生组织、中国等规定了动源性食品中的氟喹诺酮最大允许残留限量，对动物源性食品中氟喹诺酮的监测对保障食品安全具有重要意义。由于实际样品中目标物含量低，且存在复杂的基质干扰，样品必须经过预处理方可进行后续的分析检测。
固相萃取法(solidphaseextraction，spe)是一种广泛应用的样品预处理方法。高效的吸附材料是spe实现高效萃取的根本前提，也是研发新的spe技术的核心。纳米纤维膜(nanofibersmembrane,nfsm)是一种性质优越的新型固相萃取材料，根据不同的目标物和样品基质的性质，制备不同功能化修饰的纳米纤维膜作为固相萃取的吸附剂，从而建立高效的样品预处理新技术新方法，是分析化学领域研究和应用的前沿和热点之一。
技术实现要素：
技术问题：本发明的目的在于提出一种高效萃取各种动物源性食品中氟喹诺酮类兽药残留的方法，为后续的分析检测提供经过基质净化和目标物富集的待测试样。
技术方案：本发明提出一种萃取动物源性食品中氟喹诺酮类兽药残留的方法，以磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜为固相萃取吸附剂，进行各种动物源性食品中氟喹诺酮的萃取。磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜是以聚丙烯腈纳米纤维膜为模板，将间磺酸苯胺单体与苯胺单体在此模板上氧化聚合而制得。
本发明提出的一种萃取动物源性食品中氟喹诺酮类兽药残留的方法包括如下步骤：
步骤1.配制聚丙烯腈溶液进行静电纺丝得到聚丙烯腈纳米纤维膜；
步骤2.以步骤1制得的聚丙烯腈纳米纤维膜为模板，通过原位氧化聚合方法得到磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜；
步骤3.将步骤2制得的磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜用作吸附剂对动物源性食品中氟喹诺酮类兽药残留进行萃取；
其中，
①步骤1中所述聚丙烯腈纳米纤维膜按如下步骤制备：
步骤1-1.以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，配制质量浓度为10-15％(w/v)的聚丙烯腈溶液，并置于喷射容器中，喷口的孔径为0.3-0.6mm；
步骤1-2.将提供高压静电场的高压电源电压设定为12-16kv，调整喷口至铝箔接收屏的距离为10-20cm；
步骤1-3.收集1-3h后，得到聚丙烯腈纳米纤维膜。
②步骤2中，所述磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜按如下步骤制备：
步骤2-1.将0.01-0.05mol苯胺和0.01-0.05mol间磺酸苯胺加入100ml0.2-1.0moll-1的盐酸溶液中，振荡溶解，得到溶液a。
步骤2-2.将0.01-0.05mol过硫酸铵溶解在50-100毫升水中，振荡溶解，得到溶液b。
步骤2-3.将溶液a和溶液b加入到表面皿中，超声混匀，使用1moll-1盐酸溶液将混合液的ph值调整为3。
步骤2-4.将步骤1中制得的聚丙烯腈纳米纤维膜浸入步骤2-3的混合液中，在4℃反应10-20小时后，将得到的纳米纤维膜反复用水洗涤，直到洗涤液变成无色。
步骤2-5.将上述纳米纤维膜置于40-60℃的真空干燥箱进行干燥，得到磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜。
③步骤3中，所述磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜用作固相萃取吸附剂进行样品前处理按如下步骤进行。
步骤3-1.将磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜剪成圆片状，放置于固相萃取小柱中。
步骤3-2.按超纯水-5-10％(v/v)甲酸乙腈-超纯水的顺序，对步骤3-1中放置于固相萃取小柱中的磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜进行活化。
步骤3-3.采用振荡、匀浆、超声提取、离心，盐析等的任意一种或几种方法，将动物源性食品初步处理为样品溶液，之后将样品溶液通过固相萃取小柱，复杂基质中的目标物即被磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜吸附。
步骤3-4.对吸附在固相萃取小柱上的杂质使用超纯水或乙腈-水混合物进行淋洗。
步骤3-5.使用的10％(v/v)甲酸乙腈将目标物洗脱下来。将洗脱液氮吹至干，然后用0.2％(v/v)甲酸水进行复溶并进样检测。
以上所述的动物源性食品包括水产品、禽畜肉及内脏、蛋、奶以及它们的加工产品。
有益效果：氟喹诺酮类抗菌药物被广泛应用于畜牧和水产养殖业，进行动物源性食品(水产品、禽畜肉及内脏、蛋、奶以及它们的加工产品)中氟喹诺酮类残留的检测是食品安全的必然要求。动物源性食品是一类基质非常复杂、干扰很多的样品，其中氟喹诺酮类含量相对较低，必须先进行样品预处理才可检测。本发明提出以磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜为吸附剂的固相萃取技术，把纳米纤维膜特殊形态结构的优势，以及根据目标物结构和性质“量身定制”的功能化修饰结合起来，实现从各种动物源性食品基质中高效萃取氟喹诺酮类兽药。与现有方法相比，因采用了磺酸化聚苯胺修饰的聚丙烯腈纳米纤维膜这一新型吸附剂，本发明的固相萃取方法具有以下优点及效果：
①从材料的功能化修饰方面：
氟喹诺酮类兽药主要是由吡啶酮酸并联氟原子取代的苯环、吡啶环或嘧啶环等组成的化合物，分子中存在π电子共轭体系，因含羧基而显酸性，同时又含有碱性氮原子而显碱性，本发明提出了一种高效萃取各种动物源性食品中氟喹诺酮类兽药残留的方法，是根据氟喹诺酮类兽药的结构和性质，“量身定制”由聚苯胺(pani)和磺酸基(-so3h)双重功能化修饰的纳米纤维膜作为固相萃取的吸附剂，建立了更高效的样品预处理新技术新方法。
主要思路和效果：pani是一类带电高分子材料，具有非定域的π电子共轭体系，可以与氟喹诺酮类兽药形成多种形式的作用力，例如π-π相互作用(两者之间形成复合π电子共轭体系)和氢键(pani骨架上仲氨基-nh的氢原子与氟喹诺酮苯环上的氟原子之间形成)；-so3h与氟喹诺酮的吡啶环或嘧啶环之间还可发生离子交换相互作用，这是通过-so3h的氢原子转移到吡啶环或嘧啶环的氮原子上形成的。这样，通过对纳米纤维进行功能化修饰，丰富了其对目标物的吸附机制，使得吸附选择性和吸附容量大为提高，实现基质复杂的动物源性食品中高效萃取氟喹诺酮类兽药残留，达到净化和浓集目标物的目的，以满足后续分析方法的可行性和灵敏度的要求，从而获得准确的检测结果。
②纳米纤维膜的特殊形态结构，使其是一种吸附-解吸附效率“双高”的材料，与常规固相萃取吸附剂相比，别具特点。
纳米纤维膜的高比表面积可提供数量众多的吸附位点，使得数毫克的纳米纤维膜就足以完成样品中目标物的吸附，萃取效率更高；纳米纤维与其它物质的相互渗透力极强，加之纳米纤维膜表面的高孔率和膜内部的网状结构，目标物分子在纤维膜中扩散传质速率快，不仅有利于进一步提高目标物的吸附效率，而且便于洗脱溶剂与纤维膜表面及内部吸附的目标物分子的相互作用，洗脱效率也可大为提升，几十至几百微升有机溶剂就可以将被吸附的目标物洗脱下来，不仅环境友好，而且可增大富集倍数，提高检测的灵敏度，同时使得所需处理的样品体积或质量也可相应减少，缩短了样品处理时间，更加快速简便，提高了样品前处理的工作效率，降低了人力物力成本。
③从使用形式上，本发明制备的纳米纤维膜由直径几十至几百纳米的纳米纤维定向或非定向堆积组成的，它是一种“整体膜”，可直接放置于于固相萃取小柱套管中即可使用，不必如传统的颗粒状吸附剂需装填成柱或包络在网格膜中才能使用，因此从根本上避免了因装填不均匀所致的“沟流效应”对样品处理结果精密度的影响，方法的稳定性和重现性更好。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1本发明应用于鱼肉样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
将本发明制备的材料应用于鱼肉样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：
以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，配制质量浓度为15％(w/v)的聚丙烯腈溶液，并置于20ml喷射容器中，喷口的孔径为0.5mm。喷口接高压电源正极，铝箔收集屏接高压电源负极。喷射电压设定为15kv，调整不锈钢针头至铝箔接收屏的距离为15cm，纺丝液推进速度为1ml/h。收集1h后，即得聚丙烯腈纳米纤维膜；
将0.01mol苯胺和0.01mol间磺酸苯胺加入100ml0.2moll-1的盐酸溶液中，振荡溶解，得到溶液a。将0.01mol过硫酸铵溶解在80毫升水中，振荡溶解，得到溶液b。将溶液a和溶液b加入到表面皿中，超声混匀，使用1moll-1盐酸溶液将混合液的ph值调整为3。将步骤(1)中制得的聚丙烯腈纳米纤维膜浸入混合液中，在4℃反应12小时后，将得到的纳米纤维膜反复用水洗涤，直到洗涤液变成无色。将上述纳米纤维膜置于50℃的真空干燥箱进行干燥，得到磺酸/聚苯胺功能化聚丙烯腈纳米纤维膜
准确称取5.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.5ml超纯水、0.5ml10％(v/v)甲酸/乙腈、0.5ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取2g鱼肉样品置于10ml离心管中，加入10mledta–mcilvaine缓冲溶液，匀浆，超声提取10min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用4ml50％(v/v)乙腈水洗涤后，保留在膜上的目标物使用500μl的10％(v/v)甲酸/乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用500μl的0.2％(v/v)甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.018-0.066μg/kg。
实施例2本发明应用于鸡肉样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
将本发明实施例1制备的磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜应用于鸡肉样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：准确称取4.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.4ml超纯水、0.4ml5％(v/v)甲酸/乙腈、0.4ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取1g鸡肉样品置于10ml离心管中，加入5mledta–mcilvaine缓冲溶液，匀浆，超声提取10min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用2ml50％(v/v)乙腈水洗涤后，保留在膜上的目标物使用200μl的10％(v/v)甲酸/乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用200μl的0.2％(v/v)甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.012-0.06μg/kg。
实施例3本发明应用于猪肉脯样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
将本发明实施例1制备的磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜应用于猪肉脯样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：准确称取9.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.4ml超纯水、0.4ml5％(v/v)甲酸/乙腈、0.4ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取2g猪肉脯样品剪碎后置于10ml离心管中，加入5mledta–mcilvaine缓冲溶液，匀浆，超声提取10min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用2ml50％(v/v)乙腈水洗涤后，保留在膜上的目标物使用500μl的10％(v/v)甲酸/乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用500μl的0.2％(v/v)甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.01-0.05μg/kg。
实施例4本发明应用于牛奶样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，配制质量浓度为10％(w/v)的聚丙烯腈溶液，并置于20ml喷射容器中，喷口的孔径为0.3mm。喷口接高压电源正极，铝箔收集屏接高压电源负极。喷射电压设定为15kv，调整不锈钢针头至铝箔接收屏的距离为10cm，纺丝液推进速度为1ml/h。收集2h后，即得聚丙烯腈纳米纤维膜；
将0.02mol苯胺和0.03mol间磺酸苯胺加入100ml0.5moll-1的盐酸溶液中，振荡溶解，得到溶液a。将0.05mol过硫酸铵溶解在60毫升水中，振荡溶解，得到溶液b。将溶液a和溶液b加入到表面皿中，超声混匀，使用1moll-1盐酸溶液将混合液的ph值调整为3。将步骤(1)中制得的聚丙烯腈纳米纤维膜浸入混合液中，在4℃反应15小时后，将得到的纳米纤维膜反复用水洗涤，直到洗涤液变成无色。将上述纳米纤维膜置于60℃的真空干燥箱进行干燥，得到磺酸/聚苯胺功能化聚丙烯腈纳米纤维膜；
将此磺酸/聚苯胺功能化聚丙烯腈纳米纤维膜应用于牛奶样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：准确称取4.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.4ml超纯水、0.4ml5％(v/v)甲酸/乙腈、0.4ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取0.5ml牛奶样品置于10ml离心管中，加入2.5mledta–mcilvaine缓冲溶液，振荡混匀，超声提取5min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用1ml超纯水洗涤后，保留在膜上的目标物使用200μl的10％(v/v)甲酸乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用200μl的0.2％甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.012-0.024μg/kg。
实施例5本发明应用于酸奶样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
将本发明实施例4制备的磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜应用于酸奶样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：准确称取5.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.5ml超纯水、0.5ml10％(v/v)甲酸/乙腈、0.5ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取1ml酸奶样品置于10ml离心管中，加入5mledta–mcilvaine缓冲溶液，振荡混匀，超声提取10min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用2ml50％(v/v)乙腈水洗涤后，保留在膜上的目标物使用500μl的10％(v/v)甲酸乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用500μl的0.2％甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.02-0.04μg/kg。
实施例6本发明应用于鸡蛋样品中氟喹诺酮药物的萃取分离
以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，配制质量浓度为15％(w/v)的聚丙烯腈溶液，并置于20ml喷射容器中，喷口的孔径为0.6mm。喷口接高压电源正极，铝箔收集屏接高压电源负极。喷射电压设定为16kv，调整不锈钢针头至铝箔接收屏的距离为20cm，纺丝液推进速度为1ml/h。收集3h后，即得聚丙烯腈纳米纤维膜；
将0.05mol苯胺和0.03mol间磺酸苯胺加入100ml1.0moll-1的盐酸溶液中，振荡溶解，得到溶液a。将0.05mol过硫酸铵溶解在50毫升水中，振荡溶解，得到溶液b。将溶液a和溶液b加入到表面皿中，超声混匀，使用1moll-1盐酸溶液将混合液的ph值调整为3。将步骤(1)中制得的聚丙烯腈纳米纤维膜浸入混合液中，在4℃反应20小时后，将得到的纳米纤维膜反复用水洗涤，直到洗涤液变成无色。将上述纳米纤维膜置于40℃的真空干燥箱进行干燥，得到磺酸/聚苯胺功能化聚丙烯腈纳米纤维膜；
将此磺酸/聚苯胺功能化聚丙烯腈纳米纤维膜应用于鸡蛋样品中氟喹诺酮药物(诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星)的萃取分离，具体步骤为：准确称取5.0mg磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜，随后将其固定在两片筛板中间，装填在固相萃取小柱中。在固相萃取之前，依次用0.5ml超纯水、0.5ml10％(v/v)甲酸/乙腈、0.5ml超纯水对固相萃取小柱中的纳米纤维膜进行活化。取1g鸡蛋样品置于10ml离心管中，加入5mledta–mcilvaine缓冲溶液，加入0.5gnacl，溶解之后，超声提取10min，离心分离，取上清液以5.0ml/min的速度通过活化后的纳米纤维膜。使用2ml50％(v/v)乙腈水洗涤后，保留在膜上的目标物使用400μl的10％(v/v)甲酸乙腈进行洗脱，洗脱液氮吹至干，使用400μl的0.2％甲酸水复溶后，进行液相色谱-质谱检测。基于磺酸化聚苯胺修饰聚丙烯腈纳米纤维膜的固相萃取法对6种氟喹诺酮的检出限为0.012-0.06μg/kg。