荧光染料GelRed对细胞DNA进行染色定量的癌症筛查和诊断方法与流程

本发明涉及dna检测
技术领域：
，具体涉及一种利用荧光染料gelred对细胞dna进行定量测量的方法，并以此进行癌症的筛查和诊断的方法。
背景技术：
：在一般情况下，正常细胞的dna含量基本相同(二倍体或者四倍体)，而癌症或其他疾病状态下的细胞dna的含量可能发生改变。用细胞(核)染色图像定量分析各细胞的dna含量来进行宫颈癌前病变的筛查已有大量报道，在北美及欧洲细胞dna图像定量分析诊断方法已作为一种常规临床检测方法之一。在国内，许多大城市也开始用全自动dna定量分析系统进行宫颈癌筛查，如期刊文献《宫颈细胞dna定量分析在宫颈癌筛查中的应用价值》(期刊名皖南医学院学报，发表日期2016-08-15)文中报道，宫颈细胞dna定量分析联合液基薄层细胞学检测可进行宫颈癌筛查，但标本的制备中通常采用的方法是：细胞涂片进行巴氏染色后进行tct检测或细胞涂片经feulgen(福尔根染色经细胞dna定量分析。这些传统的标本制备中染色方法存在以下缺点：时间长，feulgen染色方法需要2小时左右；染色操作复杂，定量准确度低。gelred是一种荧光染料，其分子式为5,5'-(6,22-dioxo-11,14,17-trioxa-7,21-diazaheptacosane-1,27-diyl)bis(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium)iodide。pubchem号：117700725。gelred可在波长285nm的紫外光下激化,发出橘黄色的285nm发射光，其强弱与该细胞的dna含量成正比。用此原理，可对细胞dna含量进行相对定量。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用荧光染料gelred对细胞dna进行定量测量的方法，可用于宫颈癌等癌症的早期筛查和诊断。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种荧光染料gelred通过细胞dna进行染色定量在癌症筛查和诊断的用途。本发明采用的另一个技术方案：利用荧光染料gelred对细胞dna进行染色定量的癌症筛查和诊断的方法，以gelred为染料对细胞涂片或细胞、组织切片中的细胞核染色，根据各细胞核的荧光强弱对各细胞核中的dna进行相对定量，该方法包括以下步骤：步骤1，细胞样本的获取；步骤2，取10*gelred工作液与对应体积细胞样本充分混合，染色2-5分钟；步骤3，当样本为悬浮细胞时需要制片。取细胞沉降仓，加2.5ml细胞分离液，盖滤网，加入染色后的细胞样本，离心沉降制片；步骤4，取制好样本玻片，清水洗涤20s，pbs洗涤30s×3次；；步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；步骤6，待干，封片；步骤7，在荧光显微镜下镜检查，通过图片分析软件对每个细胞的dna进行定量分析。步骤8，所有dna含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞被认定为疑似癌症细胞，当疑似癌症细胞的数量多于一定数量，且具备一定的外形特征，则认为该患者可能患有癌症。步骤1所述的细胞样本获取包括：取置于固定液中细胞，振荡细胞样本1min，使其悬浮；步骤1所述的细胞样本获取包括：取细胞石蜡切片使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色；干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；步骤1所述的细胞样本获取包括：取冰冻切片室温晾干15min，干燥后的切片置于二甲苯中进行透明化处理，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；所述工作液的配制具体为：用gelred粉末配制成100ug/ml的10000*工作液，然后可配置各种浓度的工作液备用，4度避光保存。本发明提供的利用荧光染料gelred对细胞dna进行定量测量的方法，具有染色时间快，操作简单，定量准确的优点；且用途广泛，能对细胞凃片、组织切片和培养细胞中细胞的dna进行定量，可用于癌症样本筛查。附图说明图1为用gelred染色的人宫颈癌细胞的荧光照片；图2为实施例一同一样本在gelred染色与feulgen染色方法下定量准确性比较；具体实施方式本发明利用荧光染料gelred对细胞dna进行定量测量的方法进行宫颈癌筛查，首先进行原液的配制：用gelred粉末溶于水配制成100ug/ml的10000*工作液，然后可配置各种浓度的工作液，放置于4度避光保存，备用；利用荧光染料gelred对细胞dna进行定量测量的方法进行宫颈癌筛查，实施例一，实时染色，包括以下步骤：步骤1：用宫颈刷从女性子宫口刷下一些细胞，把宫颈刷放置于含有酒精和甲醇的固定液中，振荡细胞样本1min，使其悬浮。步骤2，取细胞沉降仓法制片：取滤网，加2.5ml细胞分离液，盖滤网；步骤3，取33ul10*gelred工作液与300ul细胞样本，均匀混合1分钟，染色2-5min；步骤4，转移样本到制片仓；步骤5，离心，3min；步骤6，取玻片，清水洗涤20s，pbs洗涤30s×3次；步骤7，95％、100％乙醇脱水各1min；步骤8，待干，树脂封片；步骤9，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析。步骤10，鉴定dna含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞(疑似癌细胞)的数量和形态作出癌症筛查结论。一般在10000个细胞中发现的疑似癌细胞数量超过3个，则筛查结果为阳性。实施例一的对照试验例为取同一细胞样本进行常规feulgen染色(具体实验步骤再次不再赘述)，其结果参见图2，从图2可以看出，同一样本在gelred染色与feulgen染色方法下定量准确性比较：柱状图和散点图的横坐标都为细胞dna的相对含量(di，dnaindex)，纵坐标为细胞数量(柱状图)和细胞的面积(散点图)。di值为1的细胞为2倍体细胞，di为2的细胞为4倍体细胞。灰色和黑色的峰代表二倍体细胞，这些峰越尖利则代表细胞的定量越准确，我们计算了二倍体细胞dna含量(di)的cv值，这个值越小则意味着误差越小、定量越准确。实施例二，固定染色一体化，包括以下步骤：步骤1，改进细胞固定液中加入gelred工作液，使其终浓度达到(0.2-1.0ug/ml)之间。步骤2，用宫颈刷从女性子宫口刷下一些细胞，把宫颈刷放置于含gelred的固定液中，振荡细胞样本2min，使其悬浮。步骤3，在细胞沉降仓中加2.5ml细胞分离液，盖滤网；步骤4，取300ul细胞样本，转移样本到制片仓；步骤5，离心，3min；步骤6，取玻片，清水洗涤20s，pbs洗涤30s×3次；步骤7，95％、100％乙醇脱水各1min；步骤8，待干，树脂封片；步骤9，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析。步骤10，鉴定dna含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞(疑似癌细胞)的数量和形态作出癌症筛查结论。一般在10000个细胞中发现的疑似癌细胞数量超过3个，则筛查结果为阳性。实施例三，石蜡切片，包括以下步骤：步骤1，一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。步骤2，切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化。步骤3，把切片置于5*gelred染液中的浸泡10分钟。步骤4，取玻片，清水洗涤20s，pbs洗涤30s×3次；步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；步骤6，待干，树脂封片；步骤7，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析。步骤8，鉴定dna含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞的数量和形态作出癌症筛查结论。实施例四，冰冻切片，包括以下步骤：步骤1，冰冻切片室温晾干15min；步骤2，干燥后的切片置于二甲苯中进行透明化处理，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；步骤3，把切片置于5*gelred染液中的浸泡10分钟；步骤4，取玻片，清水洗涤20s，pbs洗涤30s×3次；步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；步骤6，待干，树脂封片；步骤7，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析。步骤8，鉴定dna含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞的数量和形态特征作出癌症筛查结论。本方法同样适合其他细胞样本(如痰液涂片样本、胸腹水涂片样本、组织切片等)，细胞的前期处理略有区别，但在细胞被固定后，后续的步骤完全一致。gelred的工作浓度依据样本类型和细胞的浓度可以改变，允许10倍左右的浮动，都不影响实验结果。一般的最终推荐浓度为0.5ug/ml。本发明的gelred染色与传统feulgen染色之间的比较结果如下表1：表1特征和指标gelred染色feulgen染色需要化学试剂数16预配试剂数15预配试危化试剂数01预配试剂需用时间5分钟2-3天染色步骤17染色时间3分钟>＝90分钟dna定量精度(见图2)高中检测方法荧光明场相比传统的feulgen染色方法，本发明染色时间快,实验准备、操作简单，重复性好，定量准确。当前第1页12