一种测定土壤微生物生物量碳氮含量的方法与流程

本发明涉及土壤中微生物生物量碳氮的测定方法，具体是结合利用现有的土壤dna提取技术和手段，设计出一种测量土壤微生物生物量碳氮含量的新方法。

背景技术：

土壤微生物生物量（microbialbiomass，mb）是指土壤中那些体积小于5×10³μm³的生物总量，是土壤有机质的活性部分，但活的植物体不包括在内，如活的植物根系，有些大的动物体也不应该包括在内。广义的土壤微生物量包括微生物生物量碳、氮、磷和硫，但通常认为土壤微生物生物量仅指土壤中的微生物生物量碳含量。土壤微生物作为生态系统中活跃的一部分，行使着重要的功能，一方面，土壤微生物是土壤的重要组成部分，调控生物地球化学循环过程，同时也是土壤有机质形成和养分转化的动力；另一方面，由于微生物对于生态环境变化的敏感性，在短时间内土壤微生物可以警示和预测土壤生态系统的变化，因此可将土壤微生物量作为指示生态系统功能变化的指标。近年来土壤微生物已成为国内外科学研究的热点问题之一，可参考文献：刘安榕,杨腾,徐炜,上官子健,王金洲,刘慧颖,时玉,褚海燕,贺金生.青藏高原高寒草地地下生物多样性:进展、问题与展望[j].生物多样性,2018,26(09):972-987。

土壤微生物生物量碳含量虽然只占到土壤有机碳的1%-4%，但占到整个土壤微生物干物质的40%-45%，对于土壤养分而言，它是土壤碳库中很重要的一部分，同时土壤微生物生物量碳的含量很大程度上能反应土壤中微生物数量的多少，是评价土壤质量状况的重要参数指标。与土壤微生物生物量碳类似，土壤微生物生物量氮也是土壤氮素的重要储存库，一般能占到土壤氮素的2%-7%，同样，它也参与土壤氮循环，并与土壤中各种形式的氮素均密切相关，尤其对于农田生态系统来说，土壤微生物生物量氮对施肥、耕作和灌溉等农业活动的响应十分剧烈。不同生态系统的各个土壤类型中，土壤微生物生物量碳氮的变化范围很大，即使是同一生态系统的不同植物冠层下部与裸地土壤之间，它的变异程度也很大。因此，一直以来准确测定土壤微生物生物量碳氮含量的方法都非常值得关注。

国内外研究中，已经发展了很多方法用以测定土壤微生物生物量，例如最初提出的平板计数法通过计数单个微生物数量，换算出土壤微生物生物量，该方法最为致命的缺点是只能计数可培养微生物，对不可培养的土壤微生物无能为力。之后又陆续提出的底物诱导呼吸法、腺苷三磷酸测定法、土壤几丁质分析法、磷酸脂肪酸分析法以及熏蒸培养法和熏蒸浸提法等，不同方法各有优缺点、使用条件和使用范围。总体来说，氯仿熏蒸浸提法是使用较为认可的土壤微生物生物量测定方法，其原理是：在真空干燥器中，利用真空泵抽气使干燥器底部的氯仿在真空状态下沸腾变为氯仿蒸汽，并熏蒸处理一段时间（一般为24小时，可适当延长），土壤中的微生物被氯仿蒸汽杀死致使土壤微生物细胞破裂释，放出大量遗传物质（土壤微生物dna）和细胞内含物；熏蒸处理与未熏蒸处理的土壤样品经过一定量0.5mol/l的k2so4溶液直接提取并测量可溶性有机碳和可溶性总氮，它们之间的差值经过k2so4浸提效率（kec=0.45；ken=0.54）的矫正后即可反应土壤中微生物生物量碳氮的含量。但传统氯仿熏蒸杀死土壤微生物的过程也存在很多问题。其一，熏蒸的过程中，氯仿蒸汽不溶于水，因此熏蒸效果容易受到土壤含水量的影响。此外熏蒸培养过程会受到温度的影响较大，同时熏蒸培养会损失大量无机氮，影响土壤微生物生物量氮的测量；其二，浸提效率会受到土壤ph值、土壤团聚体以及其它因素的影响，通用的提取效率有可能不适用于所用土壤样品；其三，熏蒸培养法本身就费时费力，实验条件要求高且操作麻烦。熏蒸处理时，需要仔细检查真空干燥器气密性，尽管如此，很多时候还是因为干燥器出现漏气致使实验失败。实验过程用到的氯仿是剧毒化学药品，见光易分解，人体大量吸入会引起急性中毒，长期吸入会导致慢性中毒，对身体健康危害较大。综上所述，急需开发出一种快速、准确、安全的土壤微生物生物量测定方法。

土壤微生物的研究在很长一段时间受到技术手段的制约，但近些年来，高通量测序技术和生物信息学等现代科学技术的发展极大地推动了土壤微生物学的发展。土壤微生物dna提取过程也更多的依赖于dna提取试剂盒，但商业试剂盒普遍拥有操作方便、提取效率高、获得的dna纯度高等优势，因而受到大家的青睐。标准的dna提取流程有助于获得高质量的土壤微生物dna，并且实验的可重复性高；此外，已有少量研究证明土壤微生物dna含量和土壤微生物生物量碳氮之间有正相关关系。上述两方面背景为本发明的实现提供了极大的支持。

但是如何确定土壤微生物dna含量和土壤微生物生物量碳氮之间关系以及如何明确微生物碳氮含量转化系数都还没有明确。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种测定土壤微生物生物量碳氮含量的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：提取待测土壤样品中土壤微生物dna；

步骤2：利用微量分光光度计测定所提取dna浓度并换算为单位质量土壤微生物dna含量；

步骤3：所测土壤微生物dna含量分别乘以微生物生物量碳含量转化系数fc和微生物生物量氮含量转化系数fn，计算出土壤微生物生物量碳含量和土壤微生物生物量氮含量。

优选的，上述方法中，步骤3中微生物生物量碳含量转化系数fc为37.20，微生物生物量氮含量转化系数fn为4.02。

优选的，上述方法中，步骤1的具体操作为：使用土壤微生物dna提取试剂盒，从一定质量的待测土壤样品中提取土壤微生物dna；

优选的，上述方法中，所述土壤微生物dna提取试剂盒为powersoil®dnaisolationkit试剂盒。

优选的，上述方法中，步骤2的具体操作为：利用微量分光光度计测定所提取dna的浓度，并将所测dna浓度换算为单位质量土壤中dna的含量；

优选的，上述方法中，所述微量分光光度计为nanodroptm2000uv-visspectrophotometer。

优选的，上述方法中，所述一定质量的待测土壤样品的质量为0.2~0.5g。

优选的，上述方法中，利用微量分光光度计测定所提取dna浓度并换算为单位质量土壤微生物dna含量的方法为：nanodroptm2000uv-visspectrophotometer所测dna浓度单位为ng/μl，将此单位换算为单位质量土壤中所含dna的量，其单位为μg/g，具体方法是将dna浓度乘以最终提取的dna体积再除以土壤的质量，即为单位质量土壤微生物dna含量。

本发明还提供了一种计算微生物生物量碳含量转化系数fc和微生物生物量氮含量转化系数fn的方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：收集微生物

收集陆地生态系统的土壤样品并细分为不同的微生境；

步骤2：建立dna含量与土壤微生物生物量碳和生物量氮的回归方程

1）提取微生物：提取微生境中土壤微生物dna；

2）测量土壤微生物dna浓度：用微量分光光度计测量土壤微生物dna浓度，并将所测dna浓度单位ng/μl换算为μg/g，用dna浓度乘以最终提取的dna体积，再除以土壤的质量，得到单位质量土壤微生物dna含量；

3）建立回归方程：计算微生境中单位质量土壤微生物dna含量的平均值，然后用传统氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳氮含量的平均值，分别建立单位质量土壤微生物dna含量的平均值与土壤微生物生物量碳氮含量的平均值的回归方程，使用最小二乘法，建立土壤微生物dna含量和微生物生物量碳氮含量的回归方程，当单位质量土壤微生物dna含量与实测土壤微生物生物量碳氮含量显著正相关时，将方程的回归斜率作为土壤微生物dna含量转化为微生物生物量碳含量转化系数fc和微生物生物量氮含量转化系数fn；

步骤3：验证转化系数的准确性和可靠性

在所有土壤样品的数据中，拟合dna浓度乘以转化系数计算得到微生物生物量碳氮含量数据，微生物生物量碳氮含量通过如下公式计算：

微生物生物量碳含量=fc×单位质量土壤微生物dna含量

微生物生物量氮含量=fn×单位质量土壤微生物dna含量

利用标准主轴回归拟合微生物生物量碳氮含量实测数据和微生物生物量碳氮含量计算数据的关系，当土壤微生物生物量碳氮含量实测数据和微生物生物量碳氮含量计算数据显著正相关，则确定微生物生物量碳含量转化系数fc和微生物生物量氮含量转化系数fn合格。

优选的，上述方法中，所述陆地生态系统为3-8个，微生境的数量为15-30个，优选的，陆地生态系统为荒漠、农田、草地、草甸和森林中的多种。

本发明的有益效果

本发明的方法只需要少量土壤样品提取微生物dna，便能精确估计土壤微生物生物量碳氮含量。

本发明测定土壤微生物碳氮的方法省略了氯仿熏蒸处理步骤，转化系数准确可靠，提高了土壤微生物生物量碳氮含量的测定效率，且操作相对简单，安全性高。

本发明还提供了一种重复性好，精确度高，普适性好，且简单易行的微生物碳氮含量转化系数的方法，并且应用该方法能够准确确定微生物生物量碳氮含量转化系数，应用该转化系数能够准确测定土壤微生物生物量碳含量和氮含量。

附图说明

图1为土壤微生物dna含量和微生物生物量碳氮含量相关关系图，其中，cmic和nmic代表土壤微生物生物量碳和生物量氮，***代表统计的显著性为p<0.001，图例表示5个生态系统的25个微生境。

图2为微生物生物量碳氮含量实测数据和微生物生物量碳氮含量计算数据的相关关系图，其中sma代表标准主轴回归，slope代表回归斜率，***代表统计的显著性为p<0.001。

图1和图2中的英文含义分别如下：

calculatedvalue计算值，observedvalue观测值，desert荒漠，cropland农田，meadow草地，forest森林，steppe草甸，bareland裸地，undercanopy冠下，cornhighdensity玉米高密度，cornmediumdensity玉米中密度，cornlowdensity玉米低密度，soybeansmediumdensity大豆中密度，soybeanslowdensity大豆低密度，weed杂草，flat平地，fertilize施肥地，sunnyslopes阳坡，slopes坡地，ungrazedwetlands禁牧湿地，grazedwetlands放牧湿地。

具体实施方式

以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，下述实施例不对本发明具有任何的限制，而且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例1

步骤1：收集微生物

收集荒漠、农田、草地、草甸和森林的5个主要陆地生态系统的138个土壤样品，这些土壤样品根据所处生境的差异进一步细分为25个不同的微生境，其中具体陆地生态系统和微生境为：

荒漠：冠下、裸地；

农田：玉米高密度900株/m²、玉米中密度100株/m²、玉米低密度1株/m²、大豆高密度900株/m²、大豆中密度100株/m²、大豆低密度1株/m²、杂草样地；

草地；

草甸：平地、施肥地、阳坡、坡地、禁牧湿地、放牧湿地；

森林：海拔2245米的土层深度0-20cm、20-40cm、40-60cm，海拔2416米的土层深度0-20cm、20-40cm、40-60cm，海拔2587米的土层深度0-20cm、20-40cm、40-60cm。

步骤2：建立dna含量与土壤微生物生物量碳和生物量氮的回归方程

1）提取微生物

提取25个微生境中土壤微生物dna，提取土壤微生物dna的试剂盒选用powersoil®dnaisolationkit(mobiolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa)试剂盒，准确称取0.4g土壤样品，按照powersoil®dnaisolationkit(mobiolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa)试剂盒说明书，在通风橱内提取土壤dna。

2）测量土壤微生物dna含量

测量土壤微生物dna浓度，测量土壤微生物dna浓度的仪器为微量分光光度计nanodroptm2000uv-visspectrophotometer(thermofisherscientific,usa)，nanodroptm2000uv-visspectrophotometer所测dna浓度单位为ng/μl，将此单位换算为单位质量土壤微生物dna含量，其单位为μg/g，方法是将dna浓度乘以最终提取的dna体积，再除以土壤质量，得到单位质量土壤微生物dna含量。

3）建立回归方程

计算25个微生境中土壤微生物dna含量的平均值，然后用传统氯仿熏蒸浸提法分别测定土壤微生物生物量碳氮含量的平均值，分别建立土壤微生物dna含量与土壤微生物生物量碳氮含量的回归方程，使用最小二乘法，分别建立土壤微生物dna含量和微生物生物量碳氮含量的回归方程，结果见图1。结果表明土壤微生物dna含量与土壤微生物生物量碳氮含量均为显著正相关，方程的拟合度高，r²分别为0.94和0.92，方程的回归斜率分别作为土壤微生物dna含量转化为微生物生物量碳含量转化系数fc和微生物生物量氮含量转化系数fn，计算得到转化系数分别为：fc=37.20，fn=4.02。

步骤3：验证转化系数的准确性和可靠性

在所有138个土壤样品的数据中，拟合土壤微生物dna含量乘以微生物生物量碳氮含量转化系数，计算得到微生物生物量碳氮含量，土壤微生物生物量碳氮含量通过如下公式计算：

土壤微生物生物量碳含量=37.20×单位质量土壤微生物dna含量

土壤微生物生物量氮含量=4.02×单位质量土壤微生物dna含量

利用标准主轴回归拟合微生物生物量碳氮含量实测数据和微生物生物量碳氮含量计算数据的关系，结果如图2所示，结果发现土壤微生物生物量碳氮含量实测数据和土壤微生物生物量碳氮含量计算数据显著正相关，r²分别为0.91和0.88，结果表明dna含量分别乘以这两个转化系数均能较为准确的反应实测土壤微生物生物量碳氮含量。

以上对本发明实施方式所提供的内容进行了详细介绍，本文对本发明的原理及实施方式进行了阐述与说明，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。