宽场荧光成像激光照明装置及其使用方法与流程

本发明是关于一种宽场荧光成像激光照明装置及其使用方法，涉及显微成像技术领域。

背景技术：

伴随着激光技术的快速发展，传统的光学显微镜与之联用发展成至今广泛应用的荧光显微镜，同时随着生物分子学和纳米材料科学等的发展，研究的对象由微米尺度向纳米尺度的递进，更高分辨率和信噪比的技术手段成为影像学不断追求的目标。宽场成像技术比如受激发射损耗荧光超分辨技术以及全内反射荧光显微技术等尖端技术为生命科学开拓了一条观察生命活细胞的结构及特定分子、离子生物学变化的新途径，成为分子细胞生物学、神经科学、药理学以及遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。宽场成像技术是一种对荧光进行定性和定量研究的重要工具，在生物、化学和物理等基础科学和应用科学领域具有重要应用。作为照明光源，激光相对普通光源其单色性、准直性和照明强度等方面都具有天然的优势，足以激发浓度较低的荧光样品使其发射荧光可以达到检测标准。

宽场成像技术由来已久，传统商业化设备虽然可以满足大多功能，但是大多依赖于进口，价格高昂，维护费用昂贵，且定制需求扩展繁复。为满足特殊需求，可以通过自行搭建仪器实现，然而光路设计稍微不合理往往会导致光路具有不可靠性，而调节维护时“牵一发而动全身”，大大降低了仪器使用者的效率。

目前，激光光路尤其是成像光路搭建复杂、调节困难、灵活性低、重复性差、调节精准性低等一系列问题，因此搭建一种可靠、用户友好且多自由度集成化的宽场成像显微镜激光照明系统对获取高信噪比图像，提升科研效率具有重要的意义。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够降低系统复杂度且简捷可调的宽场荧光成像激光照明装置及其使用方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种宽场荧光成像激光照明装置，该装置包括：

激发光源单元，用于为样品提供激发光；

光学单元，包括依次设置的第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜，用于改变激发光的光路传播方向；

显微单元，用于完成样品的荧光成像；

机械单元，用于设置所述第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜，并对各所述反射镜的平动自由度和转动自由度进行调节。

在一个优选的实施例中，所述显微单元包括会聚透镜、二向色镜和物镜，经所述光学单元出射的光进入所述显微单元，所述会聚透镜对光束聚焦后发射到所述二向色镜，经所述二向色镜出射的光聚焦至所述物镜的后焦平面，并通过所述物镜聚焦至物平面，实现对样品的照明。

在一个优选的实施例中，所述会聚透镜主点到所述物镜后焦平面的距离等于所述会聚透镜的焦距，且所述第ⅲ反射镜的反射点到所述会聚透镜的距离也与所述会聚透镜的焦距相同，所述会聚透镜使入射激光所在平面处于物平面的共轭面上，其中，所述样品所处的物平面，所述物镜的后焦平面，所述会聚透镜主点所处的位置互为共轭面。

在一个优选的实施例中，所述会聚透镜采用消色差透镜。

在一个优选的实施例中，所述机械单元包括：三个十字交叉滚柱平移台，用于控制各反射镜的平动轴自由度，其中，所述第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜共享y方向的同一平移台，所述第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜共享x方向的同一平移台，所述第ⅲ反射镜单独固定在z方向的平移台；三个二维调节平面镜镜架，用于调节各反射镜的转动自由度，其中，所述第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜分别装配于所述二维调节平面镜镜架，转动轴为各自的所述二维调节平面镜镜架的θy，θz轴，θy轴为围绕y方向旋转的中心轴，θz为围绕z方向旋转的中心轴。

在一个优选的实施例中，所述第ⅰ反射镜具有一个平动自由度和两个转动自由度，所述第ⅱ反射镜具有两个平动自由度和两个转动自由度，所述第ⅲ反射镜具有三个平动自由度和两个转动自由度。

在一个优选的实施例中，仅调节所述第ⅲ反射镜任一转动轴θy，θz，实现在y和z方向的全内反射，实现落射式照明和全内反射照明切换。

在一个优选的实施例中，所述激发光源单元包括连续或脉冲激光器、扩束镜和准直透镜，所述激光器发出的激光经所述扩束镜进行两级扩束，并将扩束后的激光经所述准直透镜准直成为平行光束。

在一个优选的实施例中，所述第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜均采用所属波长介质膜反射镜。

第二方面，本发明还提供一种宽场荧光成像激光照明装置的使用方法，具体过程为：

固定物平面，调节显微单元的物镜；

将激发光源单元发出的平行光束①沿着y方向入射至第ⅰ反射镜形成反射光束②；

固定所有反射镜的平动轴，将反射光束②通过调节第ⅰ反射镜的二维调节平面镜镜架微调反射光束②使其与主光轴平行；

微调后的反射光束②入射至第ⅱ反射镜形成反射光束③，将反射光束③通过调节第ⅱ反射镜的二维调节平面镜镜架将反射光束③微调至垂直于物平面；

微调后的反射光束③入射至第ⅲ反射镜形成反射光束④，将反射光束④通过调节第ⅲ反射镜的二维调节平面镜镜架微调至与微调后的反射光束②垂直，并在微调后反射光束②和微调后反射光束③所形成的平面内；

根据物平面和显微单元的物镜工作距离确定会聚位置，锁定所有反射镜的转动轴，调节第ⅲ反射镜的平动轴将反射光束④以引入显微单元的会聚透镜的中心，此时为落射式照明；锁定所有反射镜的平动轴，仅转动第ⅲ反射镜的任一转动轴，实现全内反射照明切换。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：

1、本发明能够将不同高度的激光进行提升，减小光路复杂性，从而提升成像质量、提高用户友好性、而且可以有效降低成本；

2、本发明采用光学元件较少，可以减少激光经过多重反射造成的功率损失，提高实验效率，激光光路构成简单，用户友好，易于调节，成本低廉、重复利用性强，调节精度高；

3、本发明配合合适光电设备可达到单分子荧光成像级别的质量，并且可以广泛灵活应用于现有显微镜或者自建成像系统，或者基于成像扩展技术的基本配置；

综上，本发明可以广泛应用于样品的荧光成像。

附图说明

图1为本发明实施例的结构示意图；

图2为本发明实施例显微单元结构视图；

图3为本发明实施例显微镜后视图；

图4为本发明实施例落射式照明的荧光图像；

图5为本发明实施例全内反射式照明的荧光图像；

图中附图标记为：

1激发光源单元；

2光学单元、21第ⅰ反射镜、22第ⅱ反射镜、23第ⅲ反射镜；

3显微单元、31会聚透镜、二向色镜32、33物镜；

4机械单元。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明提供的宽场荧光成像激光照明装置，包括激发光源单元，光学单元、显微单元和机械单元。

激发光源单元1，用于为样品提供激发光；具体地，激发光源单元1包括连续或脉冲激光器、扩束镜和准直透镜，激光器发出的激光经扩束镜进行两级扩束，并将扩束后的激光经准直透镜准直成为平行光束。

光学单元2，用于改变激发光的光路传播方向；具体地，光学单元包括第ⅰ反射镜21、第ⅱ反射镜22和第ⅲ反射镜23，各反射镜反射波段需要和所使用激光器相匹配，平行光束依次经过第ⅰ反射镜21、第ⅱ反射镜22和第ⅲ反射镜23反射。

显微单元3，用于完成样品的荧光成像；具体地，显微单元3包括会聚透镜31、二向色镜32和高数值孔径的物镜33。经光学单元2出射的光束进入显微单元3，经会聚透镜31对光束聚焦后发射到二向色镜32，经二向色镜32反射的光聚焦至物镜32的后焦平面，再由高数值孔径物镜33聚焦至物平面，实现对样品的照明。其中，a平面为样品所处的物平面，b平面为物镜的后焦平面，c平面为会聚透镜物方主平面与和像方主平面之间的某一平面，具体根据实际使用进行选择。

机械单元4，用于设置光学单元2的各反射镜，并对各反射镜的平动自由度和转动自由度进行调节；具体地，机械单元4包括三个十字交叉滚柱平移台和三个二维调节平面镜镜架，平动轴自由度由十字交叉滚柱位移台控制，其中，第ⅰ反射镜只有y轴自由度，第ⅱ反射镜有xy两个方向自由度，第ⅲ反射镜有xyz三个方向自由度。其中，第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜共享在y方向的同一平移台，同时第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜共享在x方向的同一平移台，第ⅲ反射镜单独固定在z方向的平移台，调节平动轴分别为x、y、z三个方向平移台，其中，z方向平行于物镜33主光轴方向，x方向与二向色镜32反射后的的主光轴平行，y方向垂直于xz平面，转动轴为各自独立的二维调节平面镜镜架的θy，θz轴，θy轴为围绕上述y方向旋转的中心轴，θz为围绕z方向旋转的中心轴。另外，第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜和第ⅲ反射镜分别装配于二维调节平面镜镜架上，三面反射镜经过合理的设计，各自装配于不同方向的平移台上，其中，第ⅰ反射镜具有一个平动自由度和两个转动自由度，第ⅱ反射镜发生应有两个平动自由度和两个转动自由度，第ⅲ反射镜具有三个平动自由度和两个转动自由度，图1所示的第ⅰ反射镜、第ⅱ反射镜、第ⅲ反射镜的箭头表示平动轴的自由度，需要说明的是十字交叉滚柱平移台和二维调节平面镜镜架可以采用各种结构，只要能够满足本申请各反射镜的平动自由度和转动自由度即可。

上述的宽场荧光成像激光照明装置，优选地，会聚透镜31位置经过合理的设计，使入射激光所在平面处于物平面的共轭面上，物镜数值孔径需要高于1.33且小于1.70。其中，样品所处的物平面，物镜的后焦平面，会聚透镜主点所处的位置互为共轭面。另外，会聚透镜31可以采用消色差透镜，采用多色激光激发，激光光源虽单色性较好，消色差透镜的选用是为了对不同波长的激光自适应，使其对不同波长的光束会聚时不会出现焦距的差异，即优化色差。具体地，会聚透镜31的位置确定方法为：会聚透镜31主点c到物镜后焦平面b的距离等于会聚透镜的焦距，且第ⅲ反射镜23的反射点到会聚透镜31的距离也与会聚透镜31的焦距相同。

上述的宽场荧光成像激光照明装置，优选地，上述的宽场荧光成像激光照明装置，优选地，仅需调节第ⅲ反射镜23任一转动轴θy，θz，即可分别实现在y和z方向的全内反射，实现落射式照明和全内反射照明切换，且调节过程中，照明区域位置几乎不变，保证原位成像。需要说明的是，二者是荧光成像照明的两种基本方式，全内反射照明：当光线从较高折射率的介质进入到较低折射率的介质时，如果入射角大于某一临界角θc(光线远离法线)时，折射光线将会消失，所有的入射光线将被反射而不进入低折射率的介质。落射式照明：照明的光通常经过物镜垂直照射于样品上。与落射照明相比，全内反射往往具有极浅(100nm)左右的照明深度，相对落射照明具有更高的信噪比。

上述的宽场荧光成像激光照明装置，优选地，各反射镜应为所属波长介质膜反射镜，对原始光束的偏振态最大限度保偏。

本发明的宽场荧光成像激光照明装置的具体使用过程为：

将激光器光源根据要求整形，固定物平面，使用卤素灯明场照明(采用卤素灯明场照明目的是确定焦平面高度)，调节物镜33高度至成像清晰，然后固定物镜33高度；

将激发光源单元1发出的平行光束①沿着y方向入射至第ⅰ反射镜21形成反射光束②；

固定所有反射镜的平动轴，将反射光束②通过调节第ⅰ反射镜21的二维调节平面镜架微调反射光束②使其与主光轴平行；

微调后的反射光束②入射至第ⅱ反射镜22形成反射光束③，将反射光束③通过调节第ⅱ反射镜的二维调节平面镜架将反射光束③微调至垂直于物平面；

微调后的反射光束③入射至第ⅲ反射镜23形成反射光束④，将反射光束④通过调节第ⅲ反射镜23的二维调节平面镜架微调至与微调后的反射光束②垂直，并在微调后反射光束②和微调后反射光束③所形成的平面内；

根据物平面和物镜工作距离确定消色差透镜位置，锁定所有反射镜的转动轴，调节第ⅲ反射镜23的平动轴将反射光束④以引入显微单元3的消色差透镜的中心，此时为落射式照明，至此调节完毕，锁定所有反射镜的平动轴，仅转动第ⅲ反射镜23的任一转动轴(θy，θz)，即可实现全内反射照明切换，同理可根据需要调节全内反射或落射式照明。

下面通过具体实施例详细说明本发明的宽场荧光成像激光照明装置的具体应用。

1、采用0.17mm厚度盖玻片作为基底，采用掺杂有苝染料的的聚苯乙烯溶液旋涂于盖玻片表面，制成200nm厚的薄膜作为样品。

3、打开激发光源单元1的激光器，使得激光器发出的激光经扩束镜进行两级扩束，并将扩束后的激光经准直透镜进行准直使之成为平行光发射到光学单元2。

4、将显微单元3的物镜33切换至数值孔径为1.49的油浸物镜，在物镜33上加入20-100μl香柏油，并对其进行调节使之达到合适的聚焦位置；并采用擅长弱光探测的电子倍增电荷耦合器件(emccd)检测单个分子的荧光信号。

5、调节物镜33至成像清晰，完成激光落射式照明，成像效果如图4所示。

6、调节第ⅲ反射镜23的θy轴，实现y方向的全内反射照明，成像效果如图5所示。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。