一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用与流程

本发明是关于一种荧光染料标记的抗体及其制备方法与应用，具体地说，是关于一种ifluor系列荧光染料标记的cd45抗体、其制备方法及其应用，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：近几年循环肿瘤细胞在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，临床应用价值显著。免疫荧光技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使荧光标记的抗体与肿瘤标志物结合，判断肿瘤细胞的存在。免疫荧光是检测循环肿瘤细胞成熟方法之一，方法简便直观，并具有可以进行形态学分析等优点。ifluortm染料是一系列优秀的荧光染料，标记跨整个可见光谱。所有的ifluortm染料有良好的水溶性，它们的亲水性使有机溶剂的使用达到最小化。ifluortm染料也有好多标签性能比经典的染料荧光标记物(如fitc，tritc，texas和)要好，并且价格便宜，可以方便地用于标记蛋白质和核酸等生物分子。cd45由一类结构相似、分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，通过脱磷酸作用激活src激酶，进而激活fyn、hck、lck和lyn，导致cd3、zap-70和cbl的活化，最终活化mapk信号转导通路，从而调节细胞因子的合成和分泌。因此cd45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟、功能调节中具有重要作用。此外cd45在细胞表面存在与否可作为某些t细胞亚群的分类标志。在生物分子标记技术中，琥珀酰亚胺酯(nhs)被证明是胺修饰的最佳试剂，因为酰胺键形成的肽键本质上与天然肽键相同，并且和天然肽键一样稳定。这些试剂总体稳定，与脂肪胺反应性和选择性良好。琥珀酰亚胺酯类化合物需要考虑的因素很少，大部分活性染料溶解于无水二甲基甲酰胺(dmf)或二甲基亚砜(dmso)中。胺与琥珀酰亚胺酯的标记反应对ph、反应缓冲液等有较高的要求。此外，很多抗体需要依赖荧光二抗才能进行荧光免疫检测，价格昂贵，且有非特异性吸附较高等缺点。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种荧光染料直接标记的抗体。本发明的另一目的在于提供一种荧光染料直接标记抗体的制备方法。本发明的另一目的在于提供一种荧光染料直接标记的抗体的应用。一方面，本发明提供了一种荧光染料标记的抗体，其是将ifluor系列荧光染料标记在cd45抗体表面而得到的。cd45是血细胞表面的重要标志物，其抗体可作为特异探针识别外周血髓系细胞表面的cd45，对于液体活检检测、特别是循环肿瘤细胞的检测非常关键。但目前cd45抗体大多为间标抗体。而本发明提供的是一种荧光染料直接标记的cd45抗体。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体中，所述ifluor系列荧光染料带有琥珀酰亚胺酯基团，优选为带有琥珀酰亚胺酯基团的ifluor647染料。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体中，ifluor系列荧光染料与cd45抗体的摩尔比为5:1～20:1。另一方面，本发明还提供了所述荧光染料标记的抗体的制备方法，该方法包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的ifluor系列荧光染料直接标记在cd45抗体表面。传统标记方法中染料是不能直接偶联cd45抗体分子，是荧光染料上修饰巯基，cd45抗体上修饰sulfo-smcc，通过氨基和巯基交联使cd45抗体分子上带有荧光基团，完成标记反应。传统的蛋白纯化方法有盐析、亲和层析等方法，本发明通过超滤纯化的方法可以缩短纯化去抗体纯化时间，以及染料去除更彻底。再通过超滤浓缩得到ifluor系列荧光染料标记的cd45抗体。具体来说，可以将ifluor647标记到cd45抗体上，获得ifluor647荧光染料标记的cd45抗体(本发明中将ifluor647荧光染料标记的cd45抗体也称为ifluor647-cd45抗体)。本发明的制备方法，在特定的条件下ifluor647荧光染料直接与cd45抗体反应，反应路线缩短，操作简单，产品纯度提高，产品损失率降低。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法中，将带有琥珀酰亚胺酯基团的ifluor系列荧光染料标记在cd45抗体表面的过程包括：将带有琥珀酰亚胺酯基团的ifluor染料溶液和cd45抗体溶液混合。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法中，所述ifluor染料溶液和cd45抗体溶液以为0.5:1～50:1优选1:1～20:1摩尔比混合，更优选摩尔比为5:1～20:1，进一步优选5:1～15:1。优选地，所述ifluor染料溶液的溶剂为dmso。优选地，所述ifluor染料浓度为1～50mm。更优选地，ifluor647染料浓度为5～20mm。优选地，所述cd45抗体溶液的溶剂为ph值7～9的缓冲溶液。更优选地，所述缓冲溶液为如下任何一种：tris-hcl缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。最优选地，所述缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。优选地，所述cd45抗体的浓度为≥0.5mg/ml。更优选地，cd45抗体的浓度为2mg/ml。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法中，ifluor染料溶液和cd45抗体溶液通过涡旋的方法进行充分混匀；优选地，于25℃混合0.5～2h；更优选地，于25℃混合0.5～1h；优选地，于5～30hz震荡仪混合；更优选地，于5～10hz震荡仪混合。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法中，所述纯化及浓缩过程包括：1)将ifluor染料溶液和cd45抗体溶液混合反应产物ifluor-cd45抗体溶于ph＝6.8～7.5的磷酸盐缓冲液中；优选地，将ifluor-cd45抗体溶解到ph＝7.2的pbs溶液中；2)将步骤1)中所得的ifluor-cd45抗体溶液转移至4ml超滤管中；优选地，超滤管截流分子量为3k～50k，更优选地，超滤管截流分子量为10k；3)将步骤2)中超滤管进行超速冷冻离心；优选地，4℃，离心力为2000～10000g，30min；更优选地，4℃，离心力为5000g，30min；4)重复步骤3)，使ifluor-cd45抗体终体积小于300μl，制得ifluor荧光染料标记的cd45抗体。根据本发明的具体实施方案，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法中，可分别测定步骤4)中ifluor荧光染料和cd45抗体的浓度，计算标记率dol。另一方面，本发明还提供了所述荧光染料标记的抗体的应用。除非另外指明，本文中的ifluor647染料指的是ifluor647荧光染料。除非另外指明，本文中的dol指的是ifluor647-cd45抗体的标记率。除非另外指明，本文中的ifc指免疫荧光细胞技术。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的荧光染料标记的抗体的制备方法包括纯化所述的ifluor-cd45抗体的过程，该纯化过程包括以下步骤(以ifluor647-cd45抗体为例进行说明)：1)将ifluor647-cd45抗体溶于缓冲液中，优选地，将ifluor647-cd45抗体溶解到ph＝6.8～7.5的磷酸盐缓冲液中，更优选地，将ifluor647-cd45抗体溶解到ph＝7.2的pbs溶液中；2)将步骤1)中所得的ifluor647-cd45抗体溶液转移至4ml超滤管中，优选地，超滤管截流分子量为3k～50k，更优选地，超滤管截流分子量为10k；3)将步骤2)中超滤管放置超速冷冻离心机中，优选地，4℃，离心力为2000～10000g，30min，更优选地，4℃，离心力为5000g，30min；4)重复步骤3)，使ifluor647-cd45抗体终体积小于300μl；5)分别测定步骤4)中ifluor647染料和cd45抗体的浓度，根据bee-lambert定律，计算标记率dol；[cd45]＝[a280－(a654×cf280)]/pε280[ifluor647]＝od654/pε654dol＝[ifluor647]/[cd45]＝[od654×pε280]/[250000×(a280-0.039a654)]；[ifluor647]为染料的浓度，根据bee-lambert定律：[ifluor647]＝εifluor647cl。[cd45]为cd45抗体浓度，根据bee-lambert定律：[cd45]＝εcd45cl。pε280为蛋白质在280nm处摩尔消光系数，例如cd45的摩尔消光系数是203000cm-1m-1。cf为染料在280nm处吸收校正因子＝a280/a654＝0.039a651。pε654为ifluor647染料在654nm处摩尔消光系数，具体数值见表1(ifluortm标记荧光染料光谱属性表)。表1具体地，本发明中还进行了以下几个方面的试验和研究：1)选择多种cd45抗体溶剂缓冲液的ph，通过计算ifluor647-cd45抗体dol及ifc染色效果，发现ph＝7～9范围内ifc染色率结果较好；2)设计不同浓度梯度的cd45抗体溶液，通过计算ifluor647-cd45抗体dol及ifc染色效果，发现cd45抗体溶液大于2mg/ml时，ifc染色率结果较好。综上所述，本发明提供了一种用于荧光染料标记抗体及其方法，本发明的方法具有反应路线缩短，操作简单，产品纯度提高，降低成本等优点。附图说明图1：hl-60细胞表面染ifluor647-cd45抗体后ifc染色效果图。图中标尺10μm。图2：hl-60细胞表面染ifluor647-cd45抗体后染色率流式分析图。图3：hl-60细胞表面染ifluor647-cd45抗体后染色荧光强度流式分析结果图。图4：ifluor647标记cd45抗体纯化后不同标记比例制品的残余荧光染料分析(高效液相色谱法)结果图。具体实施方案下面通过具体实施例及附图对本发明进行详细说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为按照现有技术的常规操作或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的超滤管的截流分子量均为10k，体积为4ml。下述实施例中所用的ifluor647荧光染料购自天津百萤生物科技有限公司。下述实施例中所用的cd45抗体、alexafluor647二抗和af647-cd45抗体均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。下述实施例中所用的蛋白脱盐柱的截流分子量均为7k，购自艾博抗(上海)贸易有限公司。下述实施例中所用的人早幼粒急性白血病细胞(hl-60)均购自医学科学院基础科学研究所的细胞库。实施例1本实施例提供一种ifluor647荧光染料标记的cd45抗体，其制备过程如下：1)ifluor647荧光染料母液配置：将ifluor647染料溶于dmso，制成5～20mmifluor647染料母液，备用；2)cd45抗体母液配置：将1mlcd45抗体放置到装有3ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的超滤管中，4℃，离心力为5000g，30min，制成2mg/mlcd45抗体母液，备用；3)标记反应：ifluor647染料母液与cd45抗体母液分别以0.5:、1:1、2:1、4:1、5:1、8:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1的摩尔比混合，25℃，于10hz震荡仪混合，1h，即得ifluor647-cd45抗体溶液；4)纯化：将上步中所得的ifluor647-cd45抗体溶液转移至4ml超滤管中，超滤管截流分子量为10k；5)将上步中的超滤管放置超速冷冻离心机中，4℃，离心力为5000g，离心30min，使ifluor647-cd45抗体终体积小于300μl；6)分别测定上步中ifluor647染料和cd45抗体的浓度，计算标记率dol；统计检测结果如表2。表2ifluor647:cd45dol0.5:11.131:14.432:15.74:18.625:114.948:116.5410:122.3215:124.4420:125.6730:123.4340:122.6450:122.5实施例2本实施例提供了一种ifluor647标记的cd45抗体的制备实验，实验过程具体如下：1)ifluor647荧光染料母液配置：将ifluor647染料溶于dmso，制成5～20mmifluor647染料母液，备用；2)cd45抗体母液配置：将1mlcd45抗体放置到装有3ml磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的超滤管中，4℃，离心力为5000g，30min，制成2mg/mlcd45抗体母液，备用；3)标记反应：ifluor647染料母液与cd45抗体母液10:1的摩尔比混合，25℃，于10hz震荡仪混合，1h，即得ifluor647-cd45抗体溶液；4)纯化：将上步中所得的ifluor647-cd45抗体溶液等分成2份，其中一份转移至4ml超滤管中，超滤管截流分子量为10k；将上步中的超滤管放置超速冷冻离心机中，4℃，离心力为5000g，离心30min，使ifluor647-cd45抗体终体积小于300μl；另一份转移至蛋白脱盐柱中，4℃，离心力为1500g，离心2min。5)分别测定上步中ifluor647染料浓度，统计检测结果如表3。表3纯化方法ifluor647染料浓度mm超滤管0.155脱盐柱0.357实施例3本实施例提供了ifluor647标记的cd45抗体的ifc染色实验，实验过程具体包括：1)制备标准hl-60细胞样片：将洁净的cx5适配载玻片置于湿盒中，向样本区中央滴加200μl包被用l-多聚赖氨酸溶液，室温静置1h后，吸除l-多聚赖氨酸溶液；对hl-60细胞进行计数并将浓度稀释为5×105个/ml。100μl细胞悬液滴加于载玻片样本区中央。向样本区缓慢补加等体积4％多聚甲醛，室温静置30min。慢速吸除多余液体。向样本区缓慢滴加100μl无水乙醇，立刻吸除，室温晾干。保湿备用。2)封闭孵育：向样本区滴加200μl封闭液。室温静置30min后吸除。3)ifluor647-cd45抗体孵育及漂洗：用抗体稀释液按1:200(v/v)配制ifluor647-cd45抗体工作液。每个样本片滴加50μlifluor647-cd45抗体工作液。将放有样本片的湿盒盖好，置于水平摇床上，最低转速，室温孵育1h后，吸除ifluor647-cd45抗体孵育液。向样本区滴加200μl清洗液，静置5min后吸除。重复三次。4)细胞核染色及漂洗：用pbs按1:100(v/v)配制dapi工作液。每个样本片滴加100μldapi工作液，室温孵育30s。孵育结束后，吸除dapi工作液。向样本区滴加200μlpbs，静置5min后吸除。重复三次。5)封片：向样本区20～40μl封片甘油。小心加盖盖玻片，避免出现气泡。吸除溢出盖玻片以外的溶液。6)cx5扫描仪扫描样片。ifluor647与cd45抗体摩尔比为10:1时，ifc染色效果参见图1，染色率流式分析参见图2，染色荧光强度流式分析参见图3。图4显示了ifluor647标记cd45抗体纯化后不同标记比例制品的残余荧光染料分析(高效液相色谱法)结果。统计染色结果如表4。表4抗体meansdnmfi〉600染色率％af647-cd452116.951337.112327226097.121ifluor647-cd45(0.5:1)200.5100.34255059923.49ifluor647-cd45(1:1)849.11457.743626171466.01ifluor647-cd45(2:1)783.71434.093508130960.08ifluor647-cd45(4:1)794.69422.412869181863.36ifluor647-cd45(5:1)2026.53543.712952252785.6ifluor647-cd45(8:1)2371.8835.471896178393.99ifluor647-cd45(10:1)2510.81922.982517239395.07ifluor647-cd45(15:1)2584.5835.472896279496.48ifluor647-cd45(20:1)2889.6835.473089299897.05ifluor647-cd45(30:1)2556.5933.453156300095.06ifluor647-cd45(40:1)2335.3899.252988288296.45ifluor647-cd45(50:1)2845.1855.413045290195.27alexafluor647二抗166.79406.3730121595.3综合ifluor647-cd45抗体的ifc染色结果，可知，ifluor647-cd45(5:1)、ifluor647-cd45(8:1)、ifluor647-cd45(10:1)、ifluor647-cd45(15:1)和ifluor647-cd45(20:1)与af647-cd45阳性对照染色率均达85％以上。当前第1页12