一种智能手机比色法快速测定焦磷酸盐的方法与流程

本发明涉及一种焦磷酸盐的快速测定方法，具体涉及一种分散液液微萃取联用智能手机比色法测定食品和水样中焦磷酸盐含量的方法，属于食品安全和环境监测技术领域。

背景技术：

焦磷酸根（ppi，p2o7^4-）是一种具有重要生理功能的阴离子，焦磷酸盐作为生命体内“能量货币”atp的水解产物，与体内新陈代谢和能量传递息息相关，如细胞内三磷酸腺苷水解和核酸复制等，同时焦磷酸根离子在生命科学、药物化学等领域起着非常重要的作用。医学研究发现，ppi的含量跟许多疾病有密切关系，如关节炎和动脉中层硬化的诊断、dna实时测序，肿瘤诊断等。此外ppi还存在于日常生活中，在食品业中作为食品添加剂使用。因此，选择性识别并检测ppi对于疾病诊断、食品安全和环境监测等方面都具有重要的意义。

目前检测食品中ppi的常规方法有紫外可见光度法、酶法、荧光法、色谱法等。常规比色法灵敏度低且无法满足低含量检测的要求，仪器分析方法的使用和维护成本较高。因此，开发出一种快速、准确、低成本ppi检测方法可以帮助基层卫生保健部门以及食监药监部门在资源匮乏的地区实现快速准确的ppi检测需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单、准确、灵敏、选择性高的焦磷酸根检测方法——智能手机比色快速测定食品和水样中焦磷酸盐含量的方法。

一、三元络合物化学传感体系及对ppi的识别性能

在ph=7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)-氢氧化钠的缓冲溶液中，邻苯二酚紫（pv）、二价铜离子与邻二氮菲（phen）以1:1:1物质的量的比络合形成绿色三元络合物体系；当在三元络合物体系中加入焦磷酸盐，会使三元络合物体系溶液的颜色由绿色变为黄色，从而实现了选择性识别样品溶液中的焦磷酸根（ppi）。

以甲醇为分散剂，氯仿为萃取剂，ph=7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠为缓冲溶液，采用分散液液微萃取（dllme）技术将上述加入了焦磷酸根的黄色络合物富集于氯仿中，并点样于喷墨打印纸，通过安卓手机软件colorgrab获得溶液的rgb颜色强度值，而溶液的rgb颜色强度值与焦磷酸根浓度有定量关系。

二、焦磷酸根的检测

1、焦磷酸根的工作曲线的建立

（1）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再分别加入不同体积0.01mol·l^-1的na4p2o7溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab在密闭测试盒中取得样斑rgb颜色强度值；

（2）空白对照液的配制：将试剂空白（不含焦磷酸盐）按上述步骤（1）同样过程显色取色，得到空白对照液的rgb颜色强度值；

（3）itotal的计算：根据样品溶液和试剂空白液的rgb值，选取颜色加和itotal=ir+ig+ib数据模型为分析信号响应值，其中

ir——样品溶液中r通道的色彩强度值

ig——样品溶液中g通道的色彩强度值

ib——样品溶液中b通道的色彩强度值

以itotal对焦磷酸根浓度做图绘制标准曲线，得到回归曲线。焦磷酸根浓度在10~90μmol·l^-1范围内与itotal颜色强度呈以下线性关系：

itotal=1.226c/μg·ml^-1+0.01023(r²=0.9994)

itotal——反应混合液中r、g、b通道颜色加和

c——焦磷酸根浓度：单位：μg·ml^-1。

2、焦磷酸根的检测

（1）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再加入1.0ml待测样品溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab在密闭测试盒中取得待测样品溶液rgb颜色强度值，并计算待测样品溶液的itotal；

（3）根据上述线性回归方程，计算得到待测液中待检ppi的浓度。

上述方法对于焦磷酸根(ppi)的检测限lod=1.2μg·ml^-1，定量限loq=4.0μg·ml^-1。

上述方法操作简单、准确、灵敏、选择性高，可实现焦磷酸根盐的可视化快速检测。

附图说明

图1为本发明喷墨打印纸上测定的ppi离子的工作曲线图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的方法及检测效果作详细说明。

实施例1、市售茶叶中焦磷酸根(ppi)含量的检测

（1）样品的配置：称取切碎搅拌均匀的市售茶叶1.0g于消解罐中,加入8.0ml硝酸和2.0ml过氧化氢溶液压力为1.0，时间为1min功率为600w的实验条件下，进行消解，消解完后，取出罐体，放至室温后，小心打开消解罐，于180℃电热板上加热赶酸至2ml左右，最后将样液定容至25ml的容量瓶中待用；

（2）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再分别加入1.0ml待测样品溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab在密闭测试盒中（cn201810932563.2）取得样液rgb颜色强度值，并计算获得itotal=ir+ig+ib；

（3）焦磷酸根(ppi)离子的浓度的计算：将上述所得itotal值代入ppi离子的回归曲线进行比对，得到待测液中待检ppi的浓度。结果见表1，焦磷酸根(ppi)离子的浓度为8.05μg·ml^-1。

实施例2、市售牛肝中焦磷酸根(ppi)含量的检测

（1）称取切碎搅拌均匀的市售牛肝1.0g于消解罐中,加入8.0ml硝酸和2.0ml过氧化氢溶液压力为1.0，时间为1min功率为600w的实验条件下，进行消解，消解完后，取出罐体，放至室温后，小心打开消解罐，于180℃电热板上加热赶酸至2ml左右，最后将样液定容至25ml的容量瓶中待用。

（2）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再加入1.0ml待测样品溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab取得待测样品溶液rgb颜色强度值，并计算待测样品溶液的itotal；

（3）焦磷酸根(ppi)离子的浓度的计算：将上述所得itotal值代入ppi离子的回归曲线进行比对，得到待测液中待检ppi的浓度。结果见表1，焦磷酸根离子的浓度为15.24μg·ml^-1。

实施例3、市售猪肉中焦磷酸根(ppi)含量的检测

（1）样品的配置：称取切碎搅拌均匀的市售猪肉1.0g于消解罐中,加入8.0ml硝酸和2.0ml过氧化氢溶液压力为1.0，时间为1min功率为600w的实验条件下，进行消解，消解完后，取出罐体，放至室温后，小心打开消解罐，于180℃电热板上加热赶酸至2ml左右，最后将样液定容至25ml的容量瓶中待用；

（2）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再加入1.0ml待测样品溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab取得待测样品溶液rgb颜色强度值，并计算待测样品溶液的itotal；

（3）焦磷酸根(ppi)离子的浓度的计算：将上述所得itotal值代入ppi离子的回归曲线进行比对，得到待测液中待检ppi的浓度。结果见表1，焦磷酸根(ppi)离子的浓度为20.32μg·ml^-1。

实施例4、市售小麦粉中焦磷酸根(ppi)含量的检测

（1）样品的配置：称取切碎搅拌均匀的市售小麦粉1.0g于消解罐中,加入8.0ml硝酸和2.0ml过氧化氢溶液压力为1.0，时间为1min功率为600w的实验条件下，进行消解，消解完后，取出罐体，放至室温后，小心打开消解罐，于180℃电热板上加热赶酸至2ml左右，最后将样液定容至25ml的容量瓶中待用；

（2）在15ml离心管中分别加入浓度1mmol·l^-1cu²⁺、1mmol·l^-1邻苯二酚紫（pv）、1mmol·l^-1邻二氮菲（phen）的三种溶液各1.0ml，振荡1~3min，再加入1.0ml待测样品溶液，定容至10ml，再将600μl甲醇和200μl的氯仿用微量进样器快速注入离心管中，涡旋振荡器振荡2min，使用离心机在4000rpm下离心10min，弃去上层水相，用微量进样器取5.0μl萃取相，点样于3×10cm喷墨打印纸上，使用智能手机软件colorgrab取得待测样品溶液rgb颜色强度值，并计算待测样品溶液的itotal；

（3）焦磷酸根(ppi)离子的浓度的计算：将上述所得itotal值代入ppi离子的回归曲线进行比对，得到待测液中待检ppi的浓度。结果见表1，焦磷酸根(ppi)离子的浓度为30.51μg·ml^-1。