一种陈皮与枳实药材的多区域薄层鉴别区分方法与流程

本发明涉及一种陈皮与枳实药材的多区域薄层鉴别区分方法。即，采用薄层鉴别的方法，在脂溶性、中极性和极性三个区域，寻找到有关陈皮和枳实药材的多成分专属区别斑点，用以区分两种药材及其组成的不同制剂。

背景技术：

中药陈皮和枳实都是中国药典历版所收载品种，陈皮为芸香科植物橘citrusreticulatablanco及其栽培变种的干燥成熟果皮；枳实则为芸香科植物酸橙citrusaurantiuml.及其栽培变种或甜橙citrussinensisosbeck的干燥幼果；二者是同科不同种的植物。经常听到的一句古语：“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。所以然者何？水土异也”，从另一个方面说明了橘和枳是很近似的植物，所含的化学成分也多类同。文献报道陈皮和枳实都含大量黄酮类化合物，如黄酮、黄烷酮、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷及多甲氧基黄酮类化合物等；生物碱也很类似如辛弗林和n-甲基酪胺等。所以目前在陈皮和枳实(或枳壳)都存在的复方制剂中都是以橙皮苷为对照，空白样品为双阴性，同时检出陈皮和枳实(或枳壳)^【1、^2】。文献1报道的香砂养胃软胶囊中陈皮、枳实定性鉴别方法如下：

取香砂养胃软胶囊5粒，剪开，取出内容物，用乙醚洗涤两次，每次20ml，滤过，弃去滤液，药渣挥干乙醚，加甲醇20ml，超声提取20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并提取液，水浴蒸干，残渣加水3～5ml，加热使溶解，滤过，滤液通过聚酰胺柱(内径2cm，长15cm，聚酰胺5g，柱层析用，14-30目)，以水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。再取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。按处方配比模拟标准工艺制成缺陈皮、枳实的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法，制成阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸(16∶8∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色荧光主斑点，而阴性样品溶液在相应的位置上无上述主斑点。

文献1的鉴别方法，繁琐、费时，仅样品处理就要花费时间5～6小时，有机溶剂150ml，而且还是以橙皮苷为对照，双阴性，无法识别样品中的陈皮与枳实。

文献2报道的胃炎宁合剂中5种药材的薄层鉴别，其中陈皮和枳壳(枳实和枳壳是同一种植物酸橙，枳实是其干燥幼果，枳壳是其干燥未成熟果实)的同时鉴别方法如下：

取胃炎宁合剂40ml，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次40ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品，加甲醇制成1mg·1ml^-1的溶液，作为对照品溶液。再取陈皮和枳壳对照药材各1g，分别加乙酸乙酯15ml，浸渍24小时，过滤，滤液蒸干，同法制成两种对照药材溶液。再取缺陈皮与枳壳的阴性样品，同法制成阴性样品溶液。吸取供试品溶液和阴性样品溶液各10μl、两种对照药材、对照品溶液各5μl分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)为展开剂，展开，展距约3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶10∶1∶1)的上层溶液为展开剂，展开，展距约8cm，取出，晾干，喷1％三氯化铝甲醇溶液，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点；阴性样品无此斑点。

文献2的鉴别方法，虽然比文献1简化了，但样品前处理也要花费时间2小时，有机溶剂150ml，加上专制的碱性硅胶g薄层板和二次展开，也是比较麻烦的。仍然是以橙皮苷为对照，双阴性，也无法区别陈皮与枳壳。

由上述两篇文献说明了目前陈皮与枳实的鉴别现状，不但方法繁琐、费时，重要的是薄层鉴别是无法区别二者的，也就是无法监控二者的投料情况。

为解决复方制剂中陈皮和枳实无法同时鉴别的难题，提供简便、快捷，高效，易于普及推广的薄层鉴别区分方法，进行了陈皮和枳实的同时薄层鉴别区分斑点专题研究。在脂溶性、中极性和极性三个区域，寻找到陈皮和枳实药材的不同专属区别斑点，用以区别同一种制剂中的该两种药材。

技术实现要素：

通过展开剂的不同组合与其比例、显色剂、薄层载体以及检测条件等参数研究，发明了陈皮和枳实药材的多区域薄层鉴别区分方法。即，用甲醇溶解或超声分别得到对照品、供试品与对照药材溶液，在脂溶性区域检出了枳实的专属区别斑点3个，陈皮的专属区别斑点7个；在中极性区域检出了枳实的专属区别斑点2个，陈皮的专属区别斑点3个；在极性区域检出了枳实的专属区别斑点1个，陈皮的专属区别斑点3个。解决了多年来因二药材成分类似，无法采用薄层鉴别区分的难题，为不同工艺制备的含陈皮和枳实复方制剂，提供了多区域同时鉴别参考方法。方法简便、快捷、高效，在不同的区域具有不同的专属区别斑点，为首次报道。以便更好地进行药材与复方制剂的质量评价与监督。

本发明解决其技术问题所采用的方案为：

(1)陈皮与枳实药材脂溶性成分薄层区别取陈皮药材0.2g、枳实药材0.1g、陈皮与枳实药材以重量比2∶1混合的混合物0.3g，分别加甲醇2ml，超声处理20分钟，上清液作为各自的供试品溶液；另取陈皮对照药材0.2g、枳实对照药材0.1g，同法制备各自对照药材溶液；吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为6∶4∶2∶0.5的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液的上层溶液为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯365nm下检视；药材的供试品色谱中，在与各自对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点；混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显5个相同荧光斑点，其中2个为陈皮的专属斑点；置紫外光灯254nm下检视；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色专属斑点；再喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，枳实与混合物供试品色谱中，在与枳实对照药材色谱相应的位置上，显4个亮蓝色荧光斑点，其中3个为枳实专属斑点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2～3个黄绿色荧光专属斑点，其中1个为鲜亮的黄绿色。

(2)陈皮与枳实药材中极性成分薄层区别取柚皮苷和橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含柚皮苷1mg溶液，作为柚皮苷对照品溶液；橙皮苷加甲醇制成饱和溶液，作为橙皮苷对照品溶液；吸取对照品溶液各10μl、鉴别(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为6∶3∶3∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；枳实与混合物供试品色谱中，在与枳实对照药材色谱相应的位置上，显2个相同的亮蓝色专属荧光斑点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2～3个相同颜色荧光专属斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显一个共有的红色斑点，而陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，还显3个棕色的专属斑点。

(3)陈皮与枳实药材极性成分薄层区别吸取(2)项下的对照品溶液10μl、供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为3∶2∶4∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色荧光斑点；置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色斑点；再喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置暗室内透过灯光检视，枳实和混合物供试品色谱中，在与柚皮苷和枳实对照药材色谱相应的位置上，分别显1个红色的专属斑点；陈皮和混合物供试品色谱中，在与橙皮苷和陈皮对照药材色谱相应的位置上，除显1个红色的专属斑点外，还在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色专属斑点。

本发明的原理如下：

依据中药各有效成分的化学结构与性质，遵循相似相容的提取原则，采用适宜的提取溶剂，简便、快捷地制备供试品与对照药材溶液。再采用不同极性的展开剂，进行展开，各种化学成分就会随着不同的展开剂，依据吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的能力不同，而在各自的薄层板上得以分离。再将多种展开的有效成分，借助于显色剂和不同的检视条件，使其呈现出不同的颜色斑点，再根据区别专属斑点的分离情况，通过不断调整展开剂组成与配比，最终获得不同区域的清晰区分专属斑点，提供陈皮、枳实与其多种复方制剂鉴别时参考应用。用以监督同一制剂中陈皮与枳实的投料情况。

本发明的创新点及有益效果如下：

1.陈皮与枳实药材以体积比6∶4∶2∶0.5的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液的上层溶液为展开剂，展开后，置紫外光灯365nm下检视；药材的供试品色谱中，在与各自对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点；混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显5个相同荧光斑点，其中2个为陈皮的专属斑点；可以作为陈皮的区别点(图1)；置紫外光灯254nm下检视，陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色斑点；而枳实在规定的点样量内，无清晰的斑点呈现，可作为陈皮的区别点(图2)；喷雾10％硫酸乙醇溶液显色后，置紫外光灯365nm下检视，枳实与混合物供试品色谱中，显4个亮蓝色荧光斑点，其中3个为枳实专属斑点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2～3个黄绿色荧光专属斑点，其中1个为鲜亮的黄绿色(图3)。这样在脂溶性区域，同一块薄层板上，三种不同的检视条件下，共检出枳实的专属区别斑点3个，陈皮的专属区别斑点7个。

2.陈皮与枳实药材以体积比6∶3∶3∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开后，紫外光灯365nm和254nm下检视，均无专属的区别斑点呈现(图略)；喷以10％硫酸乙醇溶液显色后，置紫外光灯365nm下检视；枳实与混合物供试品色谱中，在与枳实对照药材色谱相应的位置上，显2个相同的亮蓝色荧光斑点，而陈皮在规定的点样量内，斑点模糊不清，可作为枳实的专属区别点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，在rf值0.5处呈现了2个荧光斑点，枳实在规定的点样量内，斑点模糊不清，可作为陈皮的专属区别点(图4)；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显一个共有的红色斑点，说明该展开剂，样品中的柚皮苷和橙皮苷是无法区别的；而陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，还显3个棕色的专属斑点，而枳实在规定的点样量内，无斑点呈现，可作为陈皮的专属区别点(图5)。在中极性区域，同一块薄层板上，两种不同的检视条件下，共检出枳实的专属区别斑点2个，陈皮的专属区别斑点3个，同时揭示了在该展开剂体系，样品中的柚皮苷和橙皮苷rf值相同，颜色一致，是无法区别的。

3.陈皮与枳实药材以体积比为3∶2∶4∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开后，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色荧光斑点，斑点的rf值虽然不同，但2个斑点是紧相连的，从紫外光灯365nm检视到的图谱，还说明了枳实中含有微量的橙皮苷，而陈皮中也含微量的柚皮苷(图6)，正像文献报道的那样，用柚皮苷和橙皮苷作为指标，是不能区别陈皮与枳实的；置紫外光灯254nm下检视；情况与365nm检视的图谱类似(图7)；但喷以10％硫酸乙醇溶液显色后，置暗室内透过灯光检视，枳实和混合物供试品色谱中，在与柚皮苷和枳实对照药材色谱相应的位置上，分别显1个红色的专属斑点；陈皮和混合物供试品色谱中，在与橙皮苷和陈皮对照药材色谱相应的位置上，除显1个红色的专属斑点外，还在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色专属斑点。各自药材中的微量柚皮苷和橙皮苷，因呈色的浓度积原因，在规定的点样量内，没有出现斑点，使柚皮苷和橙皮苷得以分离。这样，利用硫酸显色的红色斑点，能够区别陈皮与枳实，而且在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，还呈现了2个褐色的专属斑点(图8)。在极性区域，同一块薄层板上，三种检视条件联合应用，排除了枳实中的微量橙皮苷和陈皮中的微量柚皮苷干扰，提高了柚皮苷和橙皮苷专属性，使柚皮苷可以作为枳实的区别特征点，橙皮苷和2个褐色斑点可以作为陈皮的专属区别斑点。在极性区域检出了枳实的专属区别斑点1个，陈皮的专属区别斑点3个。

4.在非极性、中极性和极性三区域，3块薄层板上，3种检视条件下，共检出枳实的专属区别斑点6个，陈皮的专属区别斑点13个，提供药材及其制剂中枳实和陈皮药材的薄层鉴别区分参考。三个区域中的这些区别专属点，还未见相同报道。

5.方法简便、快捷、药材、对照药材和混合物，只需甲醇超声，上清液点样，展开，在不同检视条件下检视，即可。共需药材与对照药材0.1～0.3g，前处理溶剂6ml，时间20分钟，样品即处理完毕。与报道的不能区别陈皮和枳实的方法相比，其创造性、新颖性和实用性是不言而喻的。

6.本发明不仅提供了陈皮与枳实在多区域的区分方法，还为该二药材单一在制剂中存在时的多区域鉴别方法与特征斑点。

附图说明

图1为枳实、陈皮及其混合药材脂溶性成分在紫外光灯365nm下的薄层tlc图。

图2为枳实、陈皮及其混合药材脂溶性成分在紫外光灯254nm下的薄层tlc图。

图3为枳实、陈皮及其混合药材脂溶性成分，用10％硫酸乙醇溶液显色后，365nm下检视的薄层tlc图。

图4为枳实、陈皮及其混合药材中极性成分，用10％硫酸乙醇溶液显色后，365nm下检视的薄层tlc图。

图5为枳实、陈皮及其混合药材中极性成分，用10％硫酸乙醇溶液显色后，暗室内透过灯光检视的薄层tlc图。

图6为枳实、陈皮及其混合药材极性成分在紫外光灯365nm下的薄层tlc图。

图7为枳实、陈皮及其混合药材极性成分在紫外光灯254nm下的薄层tlc图。

图8为枳实、陈皮及其混合药材极性成分，用10％硫酸乙醇溶液显色后，暗室内透过灯光检视的薄层tlc图。

图1、2、3为同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1.2枳实药材；3.枳实对照药材；4.5.6枳实与陈皮混合物；7.陈皮对照药材；8.9为陈皮药材。

图4、5为同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1柚皮苷；2.枳实对照药材3.枳实药材；4.5枳实与陈皮混合物；6.陈皮对照药材；7.陈皮药材；8.橙皮苷。

图6、7、8为一块薄层板不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1.柚皮苷；2.枳实对照药材；3.枳实药材；4.枳实与陈皮混合物；5.陈皮对照药材；6.陈皮药材；7.橙皮苷。

本发明具体实施方式如下：

(1)陈皮与枳实药材脂溶性成分薄层区别取陈皮药材0.2g、枳实药材0.1g、陈皮与枳实药材以重量比2∶1混合的混合物0.3g，分别加甲醇2ml，超声处理20分钟，上清液作为各自的供试品溶液；另取陈皮对照药材0.2g、枳实对照药材0.1g，同法制备各自对照药材溶液；吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为6∶4∶2∶0.5的环己烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液的上层溶液为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯365nm下检视；药材的供试品色谱中，在与各自对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的荧光斑点；混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显5个相同荧光斑点，其中2个为陈皮的专属斑点；置紫外光灯254nm下检视；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色专属斑点；再喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，枳实与混合物供试品色谱中，在与枳实对照药材色谱相应的位置上，显4个亮蓝色荧光斑点，其中3个为枳实专属斑点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2～3个黄绿色荧光专属斑点，其中1个为鲜亮的黄绿色；

(2)陈皮与枳实药材中极性成分薄层区别取柚皮苷和橙皮苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含柚皮苷1mg溶液，作为柚皮苷对照品溶液；橙皮苷加甲醇制成饱和溶液，作为橙皮苷对照品溶液；吸取对照品溶液各10μl、鉴别(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为6∶3∶3∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；枳实与混合物供试品色谱中，在与枳实对照药材色谱相应的位置上，显2个相同的亮蓝色专属荧光斑点；陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2～3个相同颜色荧光专属斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显一个共有的红色斑点，而陈皮与混合物供试品色谱中，在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，还显3个棕色的专属斑点；

(3)陈皮与枳实药材极性成分薄层区别吸取(2)项下的对照品溶液10μl、供试品溶液和对照药材溶液各5～6μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比为3∶2∶4∶0.5的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色荧光斑点；置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与各自对照品和对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色斑点；再喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置暗室内透过灯光检视，枳实和混合物供试品色谱中，在与柚皮苷和枳实对照药材色谱相应的位置上，分别显1个红色的专属斑点；陈皮和混合物供试品色谱中，在与橙皮苷和陈皮对照药材色谱相应的位置上，除显1个红色的专属斑点外，还在与陈皮对照药材色谱相应的位置上，显2个棕褐色专属斑点。

参考文献

【1】冯学花，刘新詠，周光姣等.薄层色谱法用于香砂养胃软胶囊中陈皮、枳实定性鉴别的研究[j]，现代企业教育，2010年,第4期24页

【2】管凌燕，徐英宏，杨君等.胃炎宁合剂中5种药材的薄层鉴别[j]，华西药学杂志，2004,19(5)400-401