一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法与流程

本发明属于医学检测技术领域，涉及一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法。

背景技术：

胆碱作为人类必需营养素，可起到调节脂代谢、防治脂肪肝和心血管疾病等疾病和促进神经发育等作用。但是，胆碱水平升高与代谢综合征、心血管疾病等的发生风险呈正相关，这与胆碱依赖肠道菌群作用下生成的氧化三甲胺有着密切关系。体内高水平氧化三甲胺可影响胆固醇代谢、促进动脉粥样斑块形成和加重脂代谢紊乱。因此，测定体内氧化三甲胺含量对探讨胆碱在肠道的代谢情况及胆碱依赖肠道菌群代谢物与慢性疾病的关系有着重要的意义。

氧化三甲胺的化学结构与甲基供体如胆碱、甜菜碱和s-腺苷甲硫氨酸相似，与冠心病、心血管疾病、心房纤维颤动及动脉粥样化等疾病密相关。正常人体血液中氧化三甲胺的含量0.73～126μmol/l，测定氧化三甲胺的方法涉及使用大型精密而昂贵仪器，例如质谱法、高效液相色谱-质谱联机法等。这些方法操作复杂，成本较高不能广泛推广。现有的测定氧化三甲胺含量的方法中，分光光度法灵敏度低、效率低、重复性差；气相色谱法灵敏度高、分析速度快，适用于痕量分析，但氧化三甲胺不易挥发；离子色谱法分析氧化三甲胺速度快，但常见阳离子干扰较大；液相色谱法需要先将其衍生化处理；毛细管电泳法检出限为低、灵敏度高，但由于毛细管直径小、光路短、重复性差。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种利用顶空瓶内反应生成的三甲胺间接测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，解决了无法直接利用气相色谱测定血清中氧化三甲胺含量的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，利用顶空瓶内反应生成三甲胺，进行气相色谱测定得到氧化三甲胺的含量，包括以下步骤：

a、将人体血清注入到顶空瓶中，加入还原剂和汽化剂并加热，将人体血清中氧化三甲胺还原为三甲胺并汽化；

b、利用顶空进样器从顶空瓶中取一定体积的气体，经气相色谱分离、fid检测器测定三甲胺，经计算得到氧化三甲胺的含量。

进一步地，步骤a，所述加入人体血清的量为为顶空瓶容积的1/8-1/4。

进一步地，步骤a，所述还原剂为三氯化钛，汽化剂为饱和氢氧化钾溶液，顶空瓶容积：还原剂体积：汽化剂体积为4：0.05～0.12：0.1～0.5。

进一步地，步骤a，所述顶空瓶反应温度为60～95℃，反应时间大于2min。

进一步地，步骤b，可以利用外标法定量测定氧化三甲胺，也可以利用内标法(内标化合物为异丙胺)定量测定氧化三甲胺。

与现有技术相比，本发明利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，具有测定成本低、操作简单、灵敏度高、重现性好等优点；为评估冠心病、心脑血管疾病、心房纤维颤动及动脉粥样化等疾病的患病风险提供了氧化三甲胺含量的测定方法，实现心血管疾病的患病风险评估、筛查和预防。

附图说明

图1为氧化三甲胺在顶空瓶中还原后气相色谱仪测定的色谱图。

图2为色谱峰高与氧化三甲胺的浓度关系。

具体实施方式

实施例1

取一定体积(0.5～1ml)人体血清样品于4ml顶空瓶中，加入0.1ml三氯化钛溶液(20％)，密封后在70℃水中水浴5分钟，然后注入0.5ml饱和氢氧化钾溶液，继续在70℃水中水浴5分钟，利用顶空进样器从顶空瓶中取顶空气体1ml进行色谱分离测定。色谱条件为，载气：高纯氮气(99.999％)、柱前压：0.05mpa、气化温度：180℃、柱温：120℃、检测器：fid、检测温度180℃、色谱柱：peg-20m毛细管柱。

上述色谱条件下得到的氧化三甲胺色谱峰，其保留时间为2.365min，血清样品色谱图如图1所示。

利用上述方法，将与人体血清样品相同体积的浓度分别为0、10、50、100、150、200、250μmol/l氧化三甲胺溶液分别进行同样顶空反应和色谱分离测定得到色谱高信号与氧化三甲胺的浓度关系曲线(标准曲线)如图2所示。利用标准曲线计算即可得到人体血清中氧化三甲胺含量。

实施例2

4ml顶空瓶中，加入5.83μmol/l异丙胺0.5ml、100μmol/l氧化三甲胺0.5ml、20％三氯化钛溶液0.1ml，密封后在80℃水中水浴2分钟，然后注入0.5ml饱和氢氧化钾溶液，继续在80℃水中水浴2分钟，利用顶空进样器从顶空瓶中取顶空气体1ml在实施例1色谱条件下进行色谱分离测定，得到异丙胺峰响应值为135244，氧化三甲胺峰响应值为4616，计算得到相对校正因子f＝1.71。

含有内标物(异丙胺)的人体血清样品，在上述条件下进行顶空瓶内反应，同样色谱条件下测定得到氧化三甲胺峰响应值为ai、内标物(异丙胺)的峰响应值为as、利用如下公式计算人体血清样品氧化三甲胺含量mi：

其中，相对校正因子f＝1.71，ms为内标物(异丙胺)的含量(单位：μmol/l)。

技术特征：

1.一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于，利用顶空瓶内反应生成三甲胺，进行气相色谱测定得到氧化三甲胺的含量，包括以下步骤：

a、将人体血清注入到顶空瓶中，加入还原剂和汽化剂并加热，将人体血清中氧化三甲胺还原为三甲胺并汽化；

b、利用顶空进样器从顶空瓶中取一定体积的气体，经气相色谱分离、fid检测器测定三甲胺，计算得到氧化三甲胺的含量。

2.根据权利要求1所述的一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于：步骤a，所述加入人体血清的量为为顶空瓶容积的1/8-1/4。

3.根据权利要求1所述的一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于：步骤a，所述还原剂为三氯化钛，汽化剂为饱和氢氧化钾溶液，顶空瓶容积：还原剂体积：汽化剂体积为4：0.05～0.12：0.1～0.5。

4.根据权利要求1所述的一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于：步骤a，所述顶空瓶反应温度为60～95℃，反应时间大于2min。

5.根据权利要求1所述的一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于：步骤b，利用外标法定量测定氧化三甲胺。

6.根据权利要求1所述的一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，其特征在于：步骤b，利用内标法定量测定氧化三甲胺，其中，内标化合物为异丙胺。

技术总结
本发明涉及一种利用顶空瓶内反应测定人体血清中氧化三甲胺含量的方法，是将人体血清注入到顶空瓶中，依次加入还原剂和汽化剂并在加热条件下将血清中氧化三甲胺还原为三甲胺并汽化，利用气相色谱测定三甲胺，由此可间接得到氧化三甲胺的含量。本发明具有测定成本低、操作简单、灵敏度高、重现性好等优点。可以有效解决无法直接利用气相色谱测定血清中氧化三甲胺含量的问题。

技术研发人员：蒋本春;朱光泽;闫启盈;李俊锋;余彦霞;李美玲
受保护的技术使用者：长春中医药大学;吉林大学
技术研发日：2019.08.16
技术公布日：2019.11.22