光学超分辨显微成像系统的制作方法

本发明涉及生物医学显微成像领域。更具体地说，本发明涉及一种光学超分辨显微成像系统。

背景技术：

目前，超分辨光学显微成像技术主要有受激发射损耗显微镜技术(sted)、光激活定位显微镜技术(palm)/随机光学重建显微镜技术(storm)和结构照明(sim)三大类。

受激发射损耗显微镜技术需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光，系统结构复杂，搭建成本高昂。另外，该技术的分辨率与损耗光的光强相关，光强越高分辨率越高。而过高的损耗光光强，，会对生物样品带来额外的光损伤，这限制了该技术的适用性。

光激活定位显微成像技术/随机光学重建显微成像技术利用光谱特性对荧光分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。该技术需要大量地重复激活-激发-定位-漂白过程，需要成像几千上万次，才能重构得到超分辨图像。因此，该技术的使用受到极大的限制。

结构照明显微成像技术利用一个载频条纹的照明光在样品上形成摩尔纹(moirefringes)，样品的荧光信息通过成像系统被ccd接收，之后通过傅里叶变换将空间域和频域进行变化，从而获得超分辨图像。在实际应用中，该技术主要受限于ccd，很难在视野大小和超分辨率之间做好平衡。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种光学超分辨显微成像系统，其能够显著提高图像的分辨率，获取超分辨图像。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种光学超分辨显微成像系统，包括：

二色分光镜，其用以透过环形平行光；

聚焦透镜，其对透过二色分光镜的环形平行光进行汇聚；

共聚焦针孔，环形平行光汇聚后穿过所述共聚焦针孔，以对环形平行光进行过滤；以及

变焦透镜组，其用以将穿过所述共聚焦针孔的环形平行光准直为激发环形平行光，所述激发环形平行光依次经过扫描透镜和显微镜，然后在位于所述显微镜物镜焦平面的样品上形成直径小于所述物镜衍射极限的单一的荧光激发光斑；

探测器，其用以接收被激发的样品发射的荧光并进行处理，被激发的样品发射的荧光原路返回依次经过所述显微镜、所述扫描透镜、所述变焦透镜组、所述共聚焦针孔和所述聚焦透镜，然后所述二色分光镜将样品发射的荧光从环形平行光路中分离，转向所述探测器，以便获得样品的超分辨图像，其中，样品发射的荧光在经过所述变焦透镜组后汇聚形成的艾利斑小于等于所述共聚焦针孔，且从所述变焦透镜组出射的激发环形平行光的内径小于入射所述变焦透镜组的荧光的光束直径。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括：

光源，其用于发射激光；

准直镜和激发滤光镜，所述光源发射的激光依次经过所述准直镜和所述激发滤光镜后变成准直的激发光；

光束整形器，激发光经过所述光束整形器后被整形为环形平行光。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括依次排列的光束变形器、长焦距凸透镜和短焦距凸透镜，所述光束变形器将激发光变形为环形平行光，所述长焦距凸头镜和所述短焦距凸透镜组成的变倍镜将环形平行光的直径和厚度按设定的倍数同时进行缩小，得到所需的环形平行光。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束变形器包括依次排列的平凹锥透镜和平凸锥透镜。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束变形器为可变环形光阑。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括xy扫描振镜，其设置在所述变焦透镜组和所述扫描透镜之间，以逐点扫描位于物镜焦平面上的样品。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括三维平移台，其上设置所述样品，所述三维平移台移动带动所述样品移动以使样品被完全，均匀地扫描。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，在所述长焦距凸透镜和所述短焦距凸透镜的焦点重合处设置一滤波针孔，所述滤波针孔的直径大于环形平行光经过长焦距凸透镜汇聚后形成的主光斑直径，且小于环形平行光经过所述长焦距凸透镜汇聚后形成的第一旁瓣。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述探测器为光电探测器，所述光电探测器接收被激发的样品发射的荧光并将其转为电信号，然后传至计算机，获得样品的超分辨图像。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述探测器为面阵探测器，所述面阵探测器接收被激发的样品发射的荧光并进行成像，然后传至计算机，获得样品的超分辨图像；所述面阵探测器的具体成像过程为：

1)激发环形平行光相对样品移动时，扫描步进距离等于所述激发环形平行光在所述样品上形成的荧光激发光斑的半峰宽的n分之一，n为大于1的偶数；一共扫描x×y个点：

2)一共获取x×y张所述5×5或7×7的图像，并以此重建像素为x×y的图像；

3)重建的图像由多个强度经归一化处理的高斯圆斑叠加组成，其半峰宽为n/2个像素；

4)激发环形平行光移动至位置(a，b)时，当5×5或7×7图像的中心像素的强度最大，并且各像素的强度连续分布时，所述重建的图像才有一个中心位置在(a，b)的高斯圆斑，其强度等于所述5×5或7×7图像的中心像素的强度；

5)如果所述重建的图像有一个中心位置在(c，d)的高斯圆斑，在其两侧相距小于等于n/2个像素的位置处同时各有一个高斯圆斑，且该高斯圆斑的强度等于大于中心位置在(c，d)的高斯圆斑的强度，则所述重构的图像减去中心位于(c，d)的高斯圆斑。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括一发射滤光镜，其设置在所述二色分光镜和所述探测器之间，把其它波段的杂散光过滤掉，只透过样品发射的荧光。

优选的是，其中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述变焦透镜组由两个位置可变、焦距固定的第一透镜和第二透镜组成，或者所述变焦透镜组由一个位置可变的连续变焦透镜组成。

本发明至少包括以下有益效果：由于设置的聚焦透镜，对透过二色分光镜的环形平行光进行汇聚，环形平行光汇聚后穿过共聚焦针孔，穿过所述共聚焦针孔的环形平行光透过变焦透镜组准直为激发环形平行光，使得到的激发环形平行光依次经过扫描透镜和显微镜后能够在位于所述显微镜物镜焦平面的样品上形成直径小于所述物镜衍射极限的单一的荧光激发光斑，无需计算重构即可获得分辨率至少提高了1.6倍的超分辨图像。又由于共聚焦针孔的直径大于等于物镜的衍射极限，本发明还保持了最大的光采集效率。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中光学超分辨显微成像系统的结构示意图；

图2为本发明的另一个实施例中光学超分辨显微成像系统的结构示意图；

图3为本发明的另一个实施例中光学超分辨显微成像系统的结构示意图；

图4为本发明的另一个实施例中光学超分辨显微成像系统中变焦透镜组的结构示意图；

图5为本发明的另一个实施例中光学超分辨显微成像系统中变倍镜和滤波针孔的结构示意图；

图6为现有技术中获得的图像；

图7为采用本发明实施例获得的图像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本发明的一实施例中提供的光学超分辨显微成像系统，包括：二色分光镜8，其用以透过环形平行光；聚焦透镜9，其对透过二色分光镜8的环形平行光进行汇聚；共聚焦针孔10，环形平行光汇聚后穿过所述共聚焦针孔10，以对环形平行光进行过滤；变焦透镜组，其用以将穿过所述共聚焦针孔的环形平行光准直为激发环形平行光，所述激发环形平行光依次经过扫描透镜15和显微镜，然后在位于所述显微镜物镜19焦平面的样品20上形成直径小于所述物镜衍射极限的单一的荧光激发光斑，所述显微镜包括筒镜18和物镜19；探测器17，其用以接收被激发的样品发射的荧光并进行处理，被激发的样品发射的荧光原路返回依次经过所述显微镜、所述扫描透镜15、所述变焦透镜组、所述共聚焦针孔10和所述聚焦透镜9，然后所述二色分光镜8将样品发射的荧光从环形平行光路中分离，转向所述探测器17，以便获得样品的超分辨图像，其中，样品发射的荧光在经过所述变焦透镜组后汇聚形成的艾利斑小于等于所述共聚焦针孔，且从所述变焦透镜组出射的激发环形平行光的内径小于入射所述变焦透镜组的荧光的光束直径。

由于设置的聚焦透镜，对透过二色分光镜的环形平行光进行汇聚，环形平行光汇聚后穿过共聚焦针孔，穿过所述共聚焦针孔的环形平行光透过变焦透镜组准直为激发环形平行光，使得到的激发环形平行光依次经过扫描透镜和显微镜后能够在位于所述显微镜物镜焦平面的样品上形成直径小于所述物镜衍射极限的单一的荧光激发光斑，无需计算重构即可获得分辨率至少提高了1.6倍的超分辨图像。

在其中一具体实施方式中，所述的光学超分辨显微成像系统，如图1所示，还包括：光源1，其用于发射激光；准直镜2和激发滤光镜3，所述光源发射的激光依次经过所述准直镜2和所述激发滤光镜3后变成准直的激发光；光束整形器，激发光经过所述光束整形器后被整形为环形平行光。

为了便于形成环形平行光和得到所需大小的环形平行光，如图1所示，在其中一具体实施方式中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束整形器包括依次排列的光束变形器、长焦距凸透镜6和短焦距凸透镜7，所述光束变形器将激发光变形为环形平行光，所述长焦距凸头镜6和所述短焦距凸透镜7组成的变倍镜将环形平行光的直径和厚度按设定的倍数同时进行缩小，得到所需的环形平行光。

具体的，在其中一具体实施方式中，如图1所示，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束变形器包括依次排列的平凹锥透镜4和平凸锥透镜5。

具体的，在其中一具体实施方式中，如图3所示，所述的光学超分辨显微成像系统，所述光束变形器为可变环形光阑23。

为了便于将样品完全地被扫描，如图1所示，在其中一具体实施方式中，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括xy扫描振镜13和14，其设置在所述变焦透镜组和所述扫描透镜15之间，以逐点扫描位于物镜焦平面上的样品。

为了使样品完全被扫描，在另一种具体实施方式中，如图2所示，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括三维平移台21，其上设置所述样品20，所述三维平移台移动带动所述样品移动以使样品被完全，均匀地扫描。

在其中一具体实施方式中，如图5所示，所述的光学超分辨显微成像系统，在所述长焦距凸透镜6和所述短焦距凸透镜7的焦点重合处设置一滤波针孔26，所述滤波针孔的直径大于环形平行光经过长焦距凸透镜汇聚后形成的主光斑直径，且小于环形平行光经过所述长焦距凸透镜汇聚后形成的第一旁瓣。

为了便于接收的荧光被快速处理，在其中一具体实施方式中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述探测器17为光电探测器，所述光电探测器接收被激发的样品发射的荧光并将其转为电信号，然后传至计算机，获得样品的超分辨图像。

在另一种具体实施方式中，所述的光学超分辨显微成像系统，所述探测器17为面阵探测器，所述面阵探测器接收被激发的样品发射的荧光并进行成像，然后传至计算机，获得样品的超分辨图像；所述面阵探测器的具体成像过程为：

1)激发环形平行光相对样品移动时扫描步进距离等于所述激发环形平行光在所述样品上形成的荧光激发光斑的半峰宽的n分之一，n为大于1的偶数；一共扫描x×y个点：

2)一共获取x×y张所述5×5或7×7的图像，并以此重建像素为x×y的图像；

3)重建的图像由多个强度经归一化处理的高斯圆斑叠加组成，其半峰宽为n/2个像素；

4)激发环形平行光移动至位置(a，b)时，当5×5或7×7图像的中心像素的强度最大，并且各像素的强度连续分布时，所述重建的图像才有一个中心位置在(a，b)的高斯圆斑，其强度等于所述5×5或7×7图像的中心像素的强度；

5)如果所述重建的图像有一个中心位置在(c，d)的高斯圆斑，在其两侧相距小于等于n/2个像素的位置处同时各有一个高斯圆斑，且该高斯圆斑的强度等于大于中心位置在(c，d)的高斯圆斑的强度，则所述重构的图像减去中心位于(c，d)的高斯圆斑。

为了过滤掉被激发的样品发射的荧光中的杂光，在其中一具体实施方式中，如图1所示，所述的光学超分辨显微成像系统，还包括一发射滤光镜16，其设置在所述二色分光镜8和所述探测器17之间，把其它波段的杂散光过滤掉，只透过样品发射的荧光。

在其中一具体实施方式中，如图4所示，所述的光学超分辨显微成像系统，所述变焦透镜组由两个位置可变、焦距固定的第一透镜11和第二透镜12组成，或者所述变焦透镜组由一个位置可变的连续变焦透镜25组成。

如上所述，本发明实施例所述的系统，显著提高了图像的分辨率，使分辨率能够提高1.6倍，获取超分辨图像。如图6和图7所示，图6为现有技术获得到的图像，图7为本发明实施例获取的图像，明显看出，本发明实施例获得的图像清晰。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。