本发明涉及生物组织样本处理技术领域，具体指一种自动染色机he染色工艺。
背景技术：
苏木精—伊红染色法，简称he染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。he染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
现有的he染色工艺，细胞组织分别只用一缸苏木精染色液和一缸伊红液染色进行染色，对于没有染上色的没有补色措施，染色力度不够。
另外，采用现有方法存在细胞核染色深浅不一以及细胞浆染色深浅不一，着色过深或过浅的问题，染色稳定性不佳，细胞核与细胞质染色不够鲜艳，对比度不够鲜明，影响试验操作人员的判断，从而影响最终实验判断的准确性。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种自动染色机he染色工艺。
本发明的技术方案如下：
自动染色机he染色工艺，包括以下步骤：
(1)脱蜡：将组织切片放入二甲苯中脱蜡四次，每次脱蜡时间为5-8min；
(2)洗脱二甲苯：脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯三次，每次1-3min；
(3)组织入水：洗脱二甲苯后用高浓度到低浓度梯度的酒精依次进行组织进水过程，在每个浓度的酒精内浸泡1-3min，然后水洗，高浓度到低浓度的酒精是指体积浓度为95％、85％、75％的浓度梯度酒精；
(4)细胞核染色：水洗后将切片先后放入两缸苏木精染色液中染色，每缸浸泡5-8min，切片先放入较新一缸的苏木精染色液，然后再放入较旧一缸的苏木精染色液，然后依次进行水洗、分化返蓝、水洗，在显微镜下观察染色是否深浅合适，再用自来水冲洗蓝化8-10min；
(5)细胞质染色：用自来水蓝化后，将切片先后放入两缸伊红染色液中染色，每缸浸泡20s-60s，切片先放入较新一缸的伊红染色液，再放入较旧一缸的伊红染色液；
(6)酒精清洗：切片用伊红染色液着色后，采用低浓度到高浓度梯度的酒精依次进行组织清洗，然后再用无水乙醇洗涤三次，每次1-3min，低浓度到高浓度的酒精是指体积浓度为75％、85％、95％的浓度梯度酒精；
(7)组织透明：酒精清洗完成后，将切片分四次放在二甲苯或环保透明剂中进行透明，每次浸泡1-3min；
(8)封固：将透明后的切片用中性树胶封固。
步骤(4)所述的分化返蓝用0.05％-1％的盐酸乙醇溶液浸泡1-5s。
本发明的有益效果在于：
1.本发明细胞核、细胞质的染色液采用两缸且先新后旧的方法，新的染色液可以让细胞核或细胞质的中心部位着色鲜艳，均匀性好，而旧的染色液作为补充可以使未完全上色的部位充分着色，可以增加着色力度和染色的稳定性。
2.本发明将组织切片放入二甲苯中脱蜡四次且脱蜡后用无水乙醇洗脱二甲苯三次，脱蜡干净，且脱蜡后二甲苯洗脱干净，因此后续用染色液染色时着色均匀，细胞核、细胞质染色边界清晰，再加上细胞核、细胞质着色鲜艳，因此细胞核、细胞质对比清晰，试验准确性高。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明。
实施例1
自动染色机he染色工艺，包括以下步骤：
(1)脱蜡：将组织切片放入二甲苯中脱蜡四次，每次脱蜡时间为5min；
(2)洗脱二甲苯：脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯三次，每次1min；
(3)组织入水：洗脱二甲苯后用高浓度到低浓度梯度的酒精依次进行组织进水过程，在每个浓度的酒精内浸泡1min，然后水洗，高浓度到低浓度的酒精是指体积浓度为95％、85％、75％的浓度梯度酒精；
(4)细胞核染色：水洗后将切片先后放入两缸苏木精染色液中染色，每缸浸泡5min，切片先放入较新一缸的苏木精染色液，然后再放入较旧一缸的苏木精染色液，然后依次进行水洗、分化返蓝、水洗，在显微镜下观察染色是否深浅合适，再用自来水冲洗蓝化8min；
(5)细胞质染色：用自来水蓝化后，将切片先后放入两缸伊红染色液中染色，每缸浸泡20s，切片先放入较新一缸的伊红染色液，再放入较旧一缸的伊红染色液；
(6)酒精清洗：切片用伊红染色液着色后，采用低浓度到高浓度梯度的酒精依次进行组织清洗，然后再用无水乙醇洗涤三次，每次1min，低浓度到高浓度的酒精是指体积浓度为75％、85％、95％的浓度梯度酒精；
(7)组织透明：酒精清洗完成后，将切片分四次放在二甲苯或环保透明剂中进行透明，每次浸泡1min；
(8)封固：将透明后的切片用中性树胶封固。
步骤(4)所述的分化返蓝用0.5％-1％的盐酸乙醇溶液浸泡1s。
实施例2
自动染色机he染色工艺，包括以下步骤：
(1)脱蜡：将组织切片放入二甲苯中脱蜡四次，每次脱蜡时间为6min；
(2)洗脱二甲苯：脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯三次，每次2min；
(3)组织入水：洗脱二甲苯后用高浓度到低浓度梯度的酒精依次进行组织进水过程，在每个浓度的酒精内浸泡2min，然后水洗，高浓度到低浓度的酒精是指体积浓度为95％、85％、75％的浓度梯度酒精；
(4)细胞核染色：水洗后将切片先后放入两缸苏木精染色液中染色，每缸浸泡7min，切片先放入较新一缸的苏木精染色液，然后再放入较旧一缸的苏木精染色液，然后依次进行水洗、分化返蓝、水洗，在显微镜下观察染色是否深浅合适，再用自来水冲洗蓝化9min；
(5)细胞质染色：用自来水蓝化后，将切片先后放入两缸伊红染色液中染色，每缸浸泡40s，切片先放入较新一缸的伊红染色液，再放入较旧一缸的伊红染色液；
(6)酒精清洗：切片用伊红染色液着色后，采用低浓度到高浓度梯度的酒精依次进行组织清洗，然后再用无水乙醇洗涤三次，每次2min，低浓度到高浓度的酒精是指体积浓度为75％、85％、95％的浓度梯度酒精；
(7)组织透明：酒精清洗完成后，将切片分四次放在二甲苯或环保透明剂中进行透明，每次浸泡2min；
(8)封固：将透明后的切片用中性树胶封固。
步骤(4)所述的分化返蓝用0.5％-1％的盐酸乙醇溶液浸泡3s。
实施例3
自动染色机he染色工艺，包括以下步骤：
(1)脱蜡：将组织切片放入二甲苯中脱蜡四次，每次脱蜡时间为8min；
(2)洗脱二甲苯：脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯三次，每次3min；
(3)组织入水：洗脱二甲苯后用高浓度到低浓度梯度的酒精依次进行组织进水过程，在每个浓度的酒精内浸泡3min，然后水洗，高浓度到低浓度的酒精是指体积浓度为95％、85％、75％的浓度梯度酒精；
(4)细胞核染色：水洗后将切片先后放入两缸苏木精染色液中染色，每缸浸泡8min，切片先放入较新一缸的苏木精染色液，然后再放入较旧一缸的苏木精染色液，然后依次进行水洗、分化返蓝、水洗，在显微镜下观察染色是否深浅合适，再用自来水冲洗蓝化10min；
(5)细胞质染色：用自来水蓝化后，将切片先后放入两缸伊红染色液中染色，每缸浸泡60s，切片先放入较新一缸的伊红染色液，再放入较旧一缸的伊红染色液；
(6)酒精清洗：切片用伊红染色液着色后，采用低浓度到高浓度梯度的酒精依次进行组织清洗，然后再用无水乙醇洗涤三次，每次3min，低浓度到高浓度的酒精是指体积浓度为75％、85％、95％的浓度梯度酒精；
(7)组织透明：酒精清洗完成后，将切片分四次放在二甲苯或环保透明剂中进行透明，每次浸泡3min；
(8)封固：将透明后的切片用中性树胶封固。
步骤(4)所述的分化返蓝用0.5％-1％的盐酸乙醇溶液浸泡5s。
上述实施例1-3中，所述的较旧一缸或较新一缸的苏木精染色液是相对于一缸苏木精中对切片染色的次数多少来定的，例如一缸350ml的苏木精染色液可染2500-3000张切片，然后就倒掉原来的苏木精染色液加入新的苏木精染色液，那么刚加入苏木精染色液的一缸就是较新一缸，把对切片染色次数较少的一缸称为较新一缸的苏木精染色液；较新一缸伊红染色液或较旧一缸伊红染色液的定义原则与苏木精染色液定义原则相同。
切片经苏木精染色液着色后，用水洗以及用0.5％-1％的盐酸乙醇分化，目的是去除不应着色组织的着色和应该着色的组织过渡染色，使组织着色深浅适宜；用自来水冲洗蓝化是为了使染上苏木精的细胞核变蓝色。
对比实施例1
本实施例与实施例1的区别在于：
步骤(1)脱蜡：将组织切片放入二甲苯中脱蜡二次，每次脱蜡时间为5min；
步骤(2)洗脱二甲苯：脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯一次，每次1min；
本实施例的其它内容与实施例1相同。
对比实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
步骤(4)细胞核染色：水洗后将切片一缸苏木精染色液中染色，浸泡5min，然后依次进行水洗、分化返蓝、水洗，在显微镜下观察染色是否深浅合适，再用自来水冲洗蓝化8min；
步骤(5)细胞质染色：用自来水蓝化后，将切片放入一缸伊红染色液中染色，浸泡20s。
本实施例的其它内容与实施例1相同。
实施例1-3与对比实施例1、对比实施例2进行切片组织染色的效果对比如下表1所示：
表1
对比实施例1相对于实施例1脱蜡次数少，且脱蜡后二甲苯洗脱次数少，从表1试验结果可知，脱蜡及二甲苯洗脱不干净，会导致切片着色不均匀，细胞核、细胞质边界不清；本发明采用二甲苯四次脱蜡，脱蜡干净，且脱蜡后二甲苯洗脱干净，因此后续用染色液染色时着色均匀，细胞核、细胞质染色边界清晰。
对比实施例2相对于实施例1只用一缸苏木精染色液对细胞核染色，只用一缸伊红染色液对细胞质染色，从表1的试验结果可知，对细胞核及细胞质染色过程若不用先新后旧形式的多缸浸泡染色，会导致着色力度不佳，着色稳定性欠佳，从而导致细胞核、细胞质颜色不够鲜艳对比不够鲜明。
用两缸苏木精染色液先新后旧地对切片组织进行染色，较新一缸苏木精染色液对细胞核中心进行着色，较旧一缸苏木精染色液对细胞核进行补充着色且大多处于细胞核外围，后续进行水洗、分化返蓝的时候，只是洗掉了细胞核外围的旧的苏木精染色液，而保持细胞核中心组织是被新一缸的苏木精染色液着色，从而使着色稳定性好，确保细胞核组织着色鲜艳均匀性好；采用两缸伊红染色液先新后旧地对切片组织细胞质进行染色，与细胞核染色是同样的道理；因此细胞核、细胞质的染色液采用两缸且先新后旧的方法，新的染色液可以让细胞核或细胞质的中心部位着色鲜艳，均匀性好，而旧的染色液作为补充可以使未完全上色的部位充分着色，可以增加着色力度和染色的稳定性。