相关申请的交叉引用本申请要求于2018年10月30日提交的美国临时专利申请62/752,842的优先权，该申请通过引用将其全部纳入本申请。
背景技术：
：notch信号通路在一些正常组织和各种癌症中驱动干细胞的增殖、分化、凋亡、细胞命运和维持。notch信号通路在胚胎发育期间最活跃。notch信号的异常激活在多种肿瘤类型中被描述，并且激活的notch通路蛋白与癌症进展和治疗抗性相关。dll1(也称为δ样蛋白1)是δ/锯齿蛋白家族的成员。它在造血过程中发挥着调节细胞命运决定的作用，并且可能在细胞间通讯中起作用。dll1在许多癌症中过表达，并且针对dll1功能的抑制剂正在开发用于癌症治疗。因此，能够定量肿瘤细胞中dll1蛋白的分析方法用作癌症治疗方案的一部分是有用的，特别是，有关dll1表达水平的信息可用于选择特定的治疗方法。dll3(也称为delta-like3)，其通常在神经发育的特定时间在胎儿脑中表达。在此期间，它通过与notch和dll1相互作用并将它们分别重新定向或保留至晚期内涵体/溶酶体室或高尔基体，从而阻止它们定位至细胞表面，进而抑制顺式和反式notch通路激活。此外，dll3是几种notch配体之一，它们似乎是ascl1蛋白的直接下游靶点。同时，这些观察结果提示dll3可能与神经内分泌表型有关，并有助于神经内分泌肿瘤发生。已经开发了许多dll3抑制剂，并且正在测试它们用于治疗神经内分泌肿瘤。dll3蛋白的表达模式与肿瘤的鉴定和癌症治疗手段的选择有关，包括高级别肺神经内分泌肿瘤、小细胞肺癌(sclc)和大细胞神经内分泌癌(lcnec)的诊断和治疗。因此，能够定量肿瘤细胞中dll3蛋白的分析方法用作癌症治疗方案的一部分是有用的，特别是，关于dll3表达水平的信息可用于选择特定的治疗方法。jag1(也称为jagged1)是与哺乳动物notch信号传导通路中的受体相互作用的细胞表面蛋白(配体)。notch信号传导通路是高度保守的通路，其功能是在许多器官系统中建立和调节细胞命运决定。一旦jag1-notch(受体-配体)发生相互作用，则触发蛋白水解性裂解的级联反应，导致下游靶基因的转录激活，从而启动和促进癌症过程。已经开发了防止jag1和其notch受体之间相互作用的癌症治疗剂，因此，能够定量肿瘤细胞中的jag1蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。jag2(也称为jagged2)是与哺乳动物notch信号传导通路中的受体相互作用的细胞表面蛋白(配体)。jag2最熟知的功能是与notch2受体相互作用以激活notch信号传导通路，其可导致癌症过程的起始和进展。已经开发了阻止jag2和notch2受体之间的相互作用的癌症治疗剂，因此，可以定量肿瘤细胞中的jag2蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。notch1、notch2、notch3和notch4是具有重复的胞外egf结构域和notch(或dsl)结构域的跨膜蛋白家族。这些蛋白质参与胚胎发生中的侧向抑制，并且当异常表达时，会驱动癌细胞的生长。notch信号传导网络是进化上保守的细胞间信号传导通路，其调节物理上相邻的细胞之间的相互作用。这种1型跨膜蛋白家族的成员具有相同的结构特征，包括由多个表皮生长因子样(egf)重复组成的胞外结构域，和由多个不同的结构域类型组成的胞内结构域。这些蛋白质在反式高尔基体网络中被切割，并以异二聚体的形式呈递在细胞表面，在那里它们起到膜结合配体的受体功能，所述膜结合配体在血管、肾和肝发育中起作用。已经开发或正在开发多种notch受体抑制剂作为靶向癌症治疗剂，因此，能够定量4种notch受体中的一种的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。dll4(也称为δ样经典notch配体4)是一种作为notch配体起作用的蛋白，其特征在于具有一个dsl结构域、egf重复结构域和跨膜结构域。dll4激活notch1和notch4。dll4参与血管生成，并负调节内皮细胞增殖、迁移和血管生成萌发。dll4对视网膜祖细胞增殖是必需的，并且是抑制晚期视网膜祖细胞中的视杆细胞死亡以及其它类型的视网膜细胞正常生成所必需的。dll4的表达与驱动肿瘤过程有关，因此正在开发多种dll4抑制剂。因此，能够定量肿瘤细胞中的dll4蛋白的测定方法可以用于选择癌症治疗的方法。技术实现要素：患者的肿瘤组织中涉及notch信号传导通路的一种或多种蛋白质(包括dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4)的蛋白质表达水平可以通过定量源自每种全长蛋白质的部分序列的肽来确定。可以使用质谱技术检测每种肽，例如基于质谱的选择反应监测(srm)，也称为多重反应监测(mrm)，本发明称为srm/mrm分析。srm/mrm分析用于直接定量获自癌症患者组织的细胞中的片段肽的量，例如福尔马林固定的癌症组织。定量可以是相对的或绝对的。当需要绝对定量时，将每种肽的测量水平与已知量的具有与测量肽相同氨基酸序列的标记参考肽进行比较。所述肽对于特定蛋白质是独特的，因此，一个肽分子源自一个蛋白质分子，肽的摩尔量的测定提供了对其来源的蛋白质的摩尔量的直接测定。蛋白质表达的测量可用于癌症的诊断、癌症分期、癌症进展的预后、预测各种癌症治疗和疗法临床反应的可能性等。具体实施方式提供了基于蛋白质组学测定法的定量方法，所述方法用于定量来自癌症患者的福尔马林固定组织中的dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白。这些测定的数据可用于为例如癌症治疗作出更好的治疗决策。srm/mrm分析可用于测量从生物样品中获得的给定蛋白质制品中dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白的肽的相对或绝对定量水平。更具体地，srm/mrm分析可以直接测量从获自患者组织样品(例如福尔马林固定的癌症患者组织)所得到的细胞制备的复合蛋白裂解物样品中的这些肽。从福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述于美国专利号7,473,532中，其内容通过引用整体合并到本发明中。美国专利7,473,532中描述的方法通过使用从expressionpathology公司(罗克维尔市，马里兰州)获得的liquidtissue试剂和方案可以方便地进行实施。来自癌症患者组织的最广泛和最有利的组织形式是福尔马林固定的石蜡包埋组织。手术切除组织的甲醛/福尔马林固定是世界范围内保存癌组织样品的最常用方法，并且是标准病理学实践的公认惯例。甲醛水溶液称为福尔马林。"100％"福尔马林由甲醛(按体积约40％或按质量约37％)饱和水溶液组成，并含有少量稳定剂，通常为甲醇以限制氧化和聚合度。保存组织的最常用方法是将整个组织在甲醛水溶液中浸泡较长时间(8小时至48小时)，甲醛水溶液通常称为10％中性缓冲福尔马林，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中以在室温下长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌组织的分子分析方法将是最被接受和广泛使用的分析癌症患者组织的方法。srm/mrm测定的结果可用于将患者或受试者的特定组织样品(例如，癌症组织样品)中dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白的精确和精密的定量水平相关联，所述组织(生物样品)是从所述患者或受试者收集并保存的。这不仅提供了关于癌症的诊断信息，而且可以用作患者的改进治疗方法的一部分。这种提供关于疾病组织或其它患者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的分析被称为伴随诊断分析。例如，该分析可设计成诊断癌症的阶段或程度，并确定患者最可能对其作出反应的治疗剂。本文所述的分析方法测量来自dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白的肽的相对或绝对水平。给定蛋白质的相对定量水平通过srm/mrm方法测定，例如，通过比较来自不同样品中某个蛋白质的单个片段肽的srm/mrm特征峰面积(例如，特征峰面积或积分片段离子强度)。或者，可以比较多个特征肽的多个srm/mrm特征峰面积，其中每种肽具有其自身特异性srm/mrm特征峰，以确定一个生物样品中相对于一个或多个另外或不同的生物样品中的相同蛋白质的蛋白质含量。这样，在相同的实验条件下，在两个或多个生物样品中相对于相同的肽，测定来自样本蛋白质的特定某个肽或多个肽的量，并因此测定指定蛋白质的量。此外，通过srm/mrm方法比较给定肽的特征峰面积与来自生物样品的相同蛋白质制品中的另一种和不同蛋白质的另一种和不同肽的特征峰面积，可以确定来自单一样品中的给定蛋白质的给定肽的相对定量。这样，在相同样品中，确定来自指定蛋白质的特定肽的量，并因此确定该蛋白质相对的量。这些方法产生了从指定蛋白质定量测定样品之间和样品内的单个肽或多个肽与另一种肽或多个肽的量，其中通过信号峰面积确定的量是彼此相对的，而与从生物样品制备的蛋白质中所选肽的绝对重量与体积之比或重量与重量之比无关。将不同样品之间的单个特征峰面积的相对定量数据标准化为每个样品所分析的蛋白质的量。可以在单一样本和/或多个样本中同时对来自多种蛋白质的多个肽和一种或多种指定蛋白质进行相对定量，以了解相对蛋白质的量，例如一种肽/蛋白质相对于其它肽/蛋白质。通过比较来自生物样品中指定蛋白质的单个肽的srm/mrm特征峰面积与添加内标的srm/mrm特征峰面积，确定指定蛋白质的绝对定量水平。在一个实施方式中，内标是衍生自指定蛋白质的相同精确肽的合成形式，其含有一个或多个用一种或多种重同位素标记的氨基酸残基。合成这种同位素标记的内标，以便当通过质谱分析时，标准品产生可预测的并且一致的srm/mrm特征峰，其不同且区别于天然肽特征峰，并且其可以用作对照峰。因此，当内标以已知量加入来自生物样品的蛋白质制品中并通过质谱法分析时，将天然肽的srm/mrm特征峰面积与内标肽的srm/mrm特征峰面积进行比较，并且该数值比较指示存在于来自生物样品的原始蛋白质制品中的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。根据每个样品分析的蛋白质的量显示片段肽的绝对定量数据。可以同时在单个样品中和/或多个样品中对多个肽和由此构成的蛋白质进行绝对定量，以了解单个生物样品和单个样品的整组中的绝对蛋白质含量。srm/mrm测定法可用于辅助诊断癌症的分期，例如直接在患者来源的组织中，例如福尔马林固定的组织，并且作为改进的治疗方法的一部分，通过帮助确定哪种治疗剂对于治疗该患者是最有利的。通过手术，例如用于治疗性去除部分或全部肿瘤，或通过为确定是否存在疑似疾病而进行的活检程序而从患者去除的癌组织，分析以确定特定的一种或多种蛋白质以及蛋白质的哪些形式是否存在于该患者组织中。此外，可以测定一种或多种蛋白质的表达水平，并与健康组织中确立的"正常"或参考水平进行比较。在健康组织中确立的蛋白质正常或参考水平可以来源于例如一个或多个没有患癌症的个体的相关组织。或者，通过分析不受癌症影响的相关组织，可以获得癌症个体的正常或参照水平。来自一种、一些或所有指定蛋白质的蛋白质水平的测定也可用于通过使用蛋白质水平来诊断被诊断患有癌症的患者或受试者的癌症阶段。衍生自指定蛋白质的单个肽的水平定义为每一分析的蛋白质裂解物总量中通过srm/mrm测定法测定的肽的摩尔量。因此，关于指定的一种或多种蛋白质的信息可用于通过将蛋白质(或来自蛋白质的片段肽)的水平与在正常组织中观察到的水平相关联来帮助确定癌症的阶段或等级。一旦在癌细胞中确定了一种或多种指定蛋白质的定量的量，该信息可与开发用于特异性治疗癌组织的治疗剂(化学和生物学的)清单进行匹配，所述癌组织的特征在于例如所测定的一种或多种蛋白质的异常表达。将来自蛋白质测定的信息与特异性靶向(例如指定蛋白质或表达该蛋白质的细胞/组织)的治疗剂清单进行匹配，定义了什么可以被称为治疗疾病的个性化医学方法。本文所述的测定方法通过使用来自患者自身组织的蛋白质分析作为诊断和治疗决策的来源形成了个体化医学方法的基础。可以通过多种方法产生衍生自指定蛋白质的合适的片段肽，包括通过使用美国专利7,473,532中提供的liquidtissue方案。liquidtissue方案和试剂能够通过蛋白水解消化组织/生物样品中的蛋白质，从福尔马林固定的石蜡包埋的组织产生适于质谱分析的肽样品。在liquidtissue方案中，组织/生物样品在缓冲液中加热较长的时间(例如，从约80℃到约100℃，持续约10分钟到约4小时)，以逆转或释放蛋白质交联。所用的缓冲液是中性缓冲液(例如，基于tris的缓冲液，或含有去污剂的缓冲液)。组织/生物样品经热处理后用一种或多种蛋白酶处理一段时间以足够破坏所述生物样品的组织和细胞结构，所述蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和内切蛋白酶lys-c。加热和蛋白水解的产物是液体的、可溶的、可稀释的生物分子裂解物。原则上，任何衍生自指定蛋白质的预测肽，例如通过用已知特异性的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化而制备的，可以用作替代报告物(surrogatereporter)，以使用基于质谱的srm/mrm测定来确定样品中指定蛋白质的丰度。类似地，任何含有在指定蛋白质中已知可能被修饰的位点的氨基酸残基的预测的肽序列也可能用于分析样品中指定蛋白质的修饰程度。然而，令人惊讶地是，发现来自上述所列蛋白质的许多潜在肽序列不适合或无效用于基于质谱的srm/mrm分析，其原因尚不明确。由于无法预测用于mrm/srm分析的合适肽，因此有必要实验性地鉴定实际liquidtissue裂解物中的经修饰和未经修饰的肽，以开发用于每一指定蛋白质的可靠且准确的srm/mrm分析。尽管不希望受任何理论的束缚，但据信一些肽可能例如难以通过质谱检测，因为它们不能很好地电离或产生不同于其它蛋白质的片段。肽在分离过程中(例如液相色谱)也不能很好地溶解，或者可能粘附到玻璃或塑料器皿上。表1中发现的从dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白质衍生的肽是通过蛋白酶消化从福尔马林固定的癌组织获得的细胞制备的复合liquidtissue裂解物中的所有蛋白质而得到。在一些实施方式中，癌组织是肿瘤，例如原发性或继发性肿瘤。除非另有说明，在每种情况下，蛋白酶是胰蛋白酶。然后通过质谱分析liquidtissue裂解物，以确定通过质谱检测和分析的源自指定蛋白质的那些肽。用于质谱分析的肽的特定优选种类的鉴定基于：1)在质谱分析liquidtissue裂解物中，通过实验确定来自蛋白质的哪个或哪些肽被电离；和2)肽在用于制备liquidtissue裂解物的方案和实验条件下存活的能力。后一种特性不仅延伸到肽的氨基酸序列，而且延伸到肽内的修饰氨基酸残基在样品制备期间以修饰形式存活的能力。本发明的方法可以是诊断目的的也可以是非诊断目的的。本发明还涉及通过质谱检测和/或定量一种或多种修饰或未修饰片段肽的量的试剂和/或设备在制备用于诊断癌症和/或选择癌症治疗策略的医疗器械中的用途。所述片段肽优选为表1所示的片段肽中的一种或多种。实施例使用liquidtissue试剂和方案制备直接从福尔马林(甲醛)固定的组织获得的细胞的蛋白质裂解物，通过组织显微解剖将细胞收集到样品管中，随后在liquidtissue缓冲液中加热细胞一段较长的时间。一旦福尔马林诱导的交联受到负面影响，然后使用蛋白酶以可预测的方式将组织/细胞消化至完全，所述蛋白酶例如包括但不限于胰蛋白酶。通过用蛋白酶消化完整的多肽，将每种蛋白质裂解物降解为肽的集合。分析每种liquidtissue裂解物(例如，通过离子阱质谱)以进行肽的多个整体蛋白质组调查，其中数据表示为通过质谱从每个蛋白裂解液中存在的所有细胞蛋白质中鉴定出来的尽可能多的肽的标识。通常使用能够进行总体分析以从单个复杂蛋白质/肽裂解物中鉴定尽可能多的肽的离子阱质谱仪或另一种形式的质谱仪。尽管srm/mrm分析可以在任何类型的质谱仪上开发和执行，包括maldi、离子阱或三重四级杆，但有利地是使用三重四级杆仪器平台。这种类型的质谱仪能够分析非常复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的目标肽，所述裂解物可以由来自细胞内含有的所有蛋白质的几十万至几百万个单独的肽组成。所述方法用于：1)从每个指定的蛋白质中鉴定候选肽，其可以用于指定蛋白质的基于质谱的srm/mrm测定，2)开发单个srm/mrm测定，或用于来自指定蛋白质的目标肽的测定，以便关联3)将定量测定应用于癌症诊断和/或最佳治疗的选择。对于notch蛋白测定，一旦于所采用条件下，在单一裂解物的单一ms分析中鉴定了尽可能多的肽，就对照肽的清单，并用于确定在该裂解物中检测到的蛋白。对多个liquidtissue裂解物重复该过程，并且将非常大的肽清单整理到单个数据集中。该类型的数据集可被认为代表可在被分析的生物样品类型中(在蛋白酶消化之后)检测到的肽，并且特别是在生物样品的liquidtissue裂解物中，并且因此包括每个指定蛋白质的肽。表1列出了在测定dll1、dll3、jag1、jag2、notch1、notch2、notch3、notch4和/或dll4蛋白的绝对或相对量中被鉴定为有用的胰蛋白酶肽。通过质谱在由福尔马林固定的石蜡包埋组织制备的liquidtissue裂解物中检测到了这些肽中的每一种。因此，每种肽可以用于定量srm/mrm分析人生物样品(包括直接在福尔马林固定的患者组织)中的指定蛋白质。表1蛋白质seqidno肽序列dll11ypavdynlvqdlkdll12hltvgeewsqdlhssgrdll33agawelrdll34laaggpwarjag15dlesaqslnrjag16qpaytlvdrjag27adealpgpaghaavrjag28edeededlgrnotch19lafetgpprnotch110lldeynlvrnotch211epvgqdavglknotch212algtllhtnlrnotch313aglgpqgprnotch314eaaaqigvrnotch415eqtplflaarnotch416slsgvgagggptprdll417dnlipaaqlkdll418qqnhtldynlapgplgr表1中所列的胰蛋白酶肽通常是从不同的人器官(包括例如前列腺、结肠和乳腺)的多种不同的福尔马林固定组织的多种liquidtissue裂解物中检测到的。分析方法1.蛋白质的srm/mrm候选片段肽的鉴定a.使用一种或多种蛋白酶(其可以包括或不包括胰蛋白酶)消化蛋白质，以从福尔马林固定的生物样品制备liquidtissue蛋白裂解物；b.在离子阱串联质谱仪上分析liquidtissue裂解物中的所有蛋白质片段，并鉴定来自指定蛋白质中的所有片段肽，其中单个片段肽不含有任何肽修饰，例如磷酸化或糖基化；c.在离子阱串联质谱仪上分析liquidtissue裂解物中的所有蛋白质片段，并鉴定来自具有肽修饰(例如磷酸化或糖基化残基)的蛋白质的所有片段肽；d.通过特定消化方法从完整的全长蛋白质产生的所有肽都可以被测量，但是用于srm/mrm分析开发的优选肽是那些通过质谱直接从福尔马林固定的生物样品制备的复杂liquidtissue蛋白质裂解物中鉴定的肽；2.来自指定蛋白质的片段肽的质谱分析a.在三重四级杆质谱仪上对liquidtissue裂解物中鉴定的单个片段肽进行srm/mrm分析，将其应用于来自蛋白质的肽：i.确定片段肽在包括但不限于以下实验的最佳色谱条件下的最佳保留时间：凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱。ii.确定肽的单同位素质量、每个肽的前体电荷状态、每个肽的前体m/z值、每个肽的m/z过渡离子和每个片段肽的各过渡离子的离子类型，以便开发用于每个肽的srm/mrm测定。iii.然后可以使用来自(i)和(ii)的信息在三重四级杆质谱仪上进行srm/mrm分析，其中每种肽都具有特征性和独特的srm/mrm特征峰，该特征峰精确地限定在三重四级杆质谱仪上进行的独特的srm/mrm分析。b.进行srm/mrm分析，使得来自srm/mrm质谱分析的独特srm/mrm特征峰面积的函数形式的所检测到的蛋白质的片段肽的量可以指示特定蛋白质裂解物中蛋白质的相对量和绝对量。i.相对定量可通过以下方法实现：1.通过比较在来自一种福尔马林固定的生物样品的liquidtissue裂解物中检测到的来自给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与来自至少第二、第三、第四或更多福尔马林固定的生物样品的至少第二、第三、第四或更多liquidtissue裂解物中相同片段肽的相同srm/mrm特征峰面积，确定蛋白质存在量的增加或减少。2.通过比较在来自一种福尔马林固定的生物样品的liquidtissue裂解物中检测到的来自给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与来自其它蛋白质的片段肽获得的srm/mrm特征峰面积，确定蛋白质存在量的增加或减少，其他蛋白质来自不同和单独的生物来源的其它样品中，其中肽片段的2个样品之间的srm/mrm特征峰面积比较被标准化为在每个样品中分析的蛋白质的量。3.通过比较给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与来源于福尔马林固定的生物样品的相同liquidtissue裂解物内的不同蛋白质的其它片段肽的srm/mrm特征峰面积来确定蛋白质存在量的增加或减少，以便将蛋白质的变化水平标准化为在不同的细胞条件下都不改变其表达水平的其它蛋白质的水平。4.这些分析可应用于蛋白质的未修饰片段肽和修饰片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中修饰肽的相对水平以与确定未修饰肽的相对量相同的方式进行确定。ii.给定肽的绝对定量可以通过比较来自单个生物样品中指定蛋白的给定片段肽的srm/mrm特征峰面积与掺入来自生物样品的蛋白裂解物的内部片段肽标准品的srm/mrm特征峰面积来实现：1.内标物是来自待分析的指定蛋白质的片段肽的标记合成形式。将该标准品以已知量掺入样品中，并且可以分别测定生物样品中内部片段肽标准品和天然片段肽的srm/mrm特征峰面积，然后比较两个峰面积。2.这可以应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中修饰肽的绝对水平可以以与确定未修饰肽的绝对水平相同的方式进行确定。3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗a.对指定蛋白质的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并如在癌症领域中所熟知的，证实了先前确定的指定蛋白质的表达与患者肿瘤组织中癌症的阶段/等级/状态的关联性。b.对指定蛋白质的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并证明其与不同治疗策略的临床结果的相关性，其中该相关性已经在本领域中得到证实，或者可以通过对患者群和来自这些患者的组织的相关性研究在将来得到证实。一旦该分析证实了先前建立的相关性或将来得到的相关性，则该分析方法可用于确定最佳治疗策略。通过在离子阱和三重四级杆质谱仪上对所有片段肽进行分析，得到了关于来自每个指定蛋白质的特定片段肽的特定和独特的特征。必须通过实验确定直接在来自福尔马林固定的样品/组织的liquidtissue裂解物中每种候选srm/mrm肽的信息；因为有趣的是，使用本文所述的srm/mrm，在这样的裂解物中不能检测到来自任何指定蛋白质的所有肽，这表明未检测到的片段肽不能被认为是用于开发srm/mrm测定的候选肽，所述srm/mrm测定用于直接定量来自福尔马林固定的样品/组织的liquidtissue裂解物中的肽/蛋白质。在三重四级杆质谱仪上进行片段肽的特定srm/mrm分析。通过特定蛋白srm/mrm分析的实验样品是例如从已被福尔马林固定和石蜡包埋的组织制备的liquidtissue蛋白裂解物。来自这种测定的数据表明福尔马林固定样品中该片段肽存在独特的srm/mrm特征峰。该肽的特异性过渡离子特征用于定量测定福尔马林固定的生物样品中的特定片段肽。这些数据表明该片段肽的绝对量是每微克所分析的蛋白质裂解物中肽的摩尔量的函数。基于福尔马林固定的患者来源的组织的分析对组织中相应蛋白质水平的评估可提供关于每个特定患者的诊断、预后和治疗相关信息。在一个实施方式中，本发明公开描述了用于测量生物样品中表1所列的每种蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量从所述生物样品制备的蛋白质消化物中的一种或多种修饰或未修饰片段肽的量；以及计算所述样品中修饰或未修饰的蛋白质的水平；并且其中所述水平是相对水平或绝对水平。在相关的实施方式中，定量一种或多种片段肽包括通过与已知量的添加的内标肽进行比较来确定生物样品中每种片段肽的量，其中将生物样品中的一种或多种片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽进行比较。在一些实施方式中，内标物是同位素标记的内标肽，其包括一种或多种选自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其组合的重稳定同位素。用于测量本文所述的生物样品中的指定蛋白质(或其替代物的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断指示。在一个实施方式中，通过将组织中发现的蛋白质水平与正常和/或癌和/或癌前病变组织中发现的蛋白质水平相关联(例如进行比较)，来自指定蛋白质水平测量的结果可用于确定癌症的诊断阶段/等级/状态。因为核酸和蛋白质都可以从相同的liquidtissue生物分子制品中进行分析，所以可以从用于蛋白质组分析的相同样品中的核酸获得关于疾病诊断和药物治疗决策的额外信息。例如，如果某一指定的蛋白质由某些细胞以增加的水平表达，当通过srm测定时，数据可以提供关于细胞状态和其不受控生长的潜力的信息，可以获得潜在的耐药性和癌症发展的信息。同时，关于相应基因和/或核酸和它们编码的蛋白质的状况的信息(例如，mrna分子和它们的表达水平或剪接变化)可以从存在于相同liquidtissue生物分子制品中存在的核酸中获得；可以与指定蛋白质的srm分析同时进行评估。不是来自指定蛋白质以及存在于相同生物分子制品中的任何基因和/或核酸，可以与指定蛋白质的srm分析同时进行评估。在一个实施方式中，关于指定蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种其它蛋白质的信息可以通过检查编码这些蛋白质的核酸来评估。例如，这些核酸可以通过以下一种或多种、两种或多种、或三种或多种方式进行检测：测序法、聚合酶链式反应法、限制性片段多态性分析、缺失、插入的鉴定，和/或突变存在的测定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。sequencelisting<110>爱科谱迅病理研究公司（expressionpathologyinc）<120>针对notch通路蛋白的srm/mrm分析<130>i59923lrh<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>13<212>prt<213>homosapiens<400>1tyrproalavalasptyrasnleuvalglnaspleulys1510<210>2<211>17<212>prt<213>homosapiens<400>2hisleuthrvalglygluglutrpserglnaspleuhissersergly151015arg<210>3<211>7<212>prt<213>homosapiens<400>3alaglyalatrpgluleuarg15<210>4<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>4leualaalaglyglyprotrpalaarg15<210>5<211>10<212>prt<213>homosapiens<400>5aspleugluseralaglnserleuasnarg1510<210>6<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>6glnproalatyrthrleuvalasparg15<210>7<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>7alaaspglualaleuproglyproalaglyhisalaalavalarg151015<210>8<211>10<212>prt<213>homosapiens<400>8gluaspglugluaspgluaspleuglyarg1510<210>9<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>9leualaphegluthrglyproproarg15<210>10<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>10leuleuaspglutyrasnleuvalarg15<210>11<211>11<212>prt<213>homosapiens<400>11gluprovalglyglnaspalavalglyleulys1510<210>12<211>11<212>prt<213>homosapiens<400>12alaleuglythrleuleuhisthrasnleuarg1510<210>13<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>13alaglyleuglyproglnglyproarg15<210>14<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>14glualaalaalaglnileglyvalarg15<210>15<211>10<212>prt<213>homosapiens<400>15gluglnthrproleupheleualaalaarg1510<210>16<211>14<212>prt<213>homosapiens<400>16serleuserglyvalglyalaglyglyglyprothrproarg1510<210>17<211>10<212>prt<213>homosapiens<400>17aspasnleuileproalaalaglnleulys1510<210>18<211>17<212>prt<213>homosapiens<400>18glnglnasnhisthrleuasptyrasnleualaproglyproleugly151015arg当前第1页12