一种深部真菌感染快速诊断试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及深部真菌感染检测技术领域，具体涉及一种深部真菌感染快速诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术：

目前市场上检测深部真菌感染指标(1,3)-β-d-葡聚糖检测试剂主要是鲎试剂和elisa检测试剂盒。

鲎试剂反应原理是(1,3)-β-d-葡聚糖激活鲎变形细胞中的g因子亚基，产生丝氨酸蛋白酶，后者可将试剂中带有寡核苷酸的发色底物(boc-leu-gly-pna)中的发色基团对硝基苯胺(pna)游离出来，并产生颜色，在405nm进行比色，待测样本溶液吸光度与溶液中(1,3)-β-d-葡聚糖浓度成正比。

elisa检测试剂盒检测原理是(1,3)-β-d-葡聚糖包被在多孔板上，并保持其免疫活性。使(1,3)-β-d-葡聚糖抗体与某种酶连接成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本和酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的(1,3)-β-d-葡聚糖起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定量分析。

现有技术存在的缺陷是：(1)鲎试剂和elisa试剂都检测时间长，一般都需要60分钟以上；(2)操作过程比较繁琐，需要进行多步骤操作才能获取结果；(3)保存运输和使用不方便，因为是液态检测试剂，所以运输过程必须要冷链运输，保存时候必须要放置于冰箱或者冷库内保存；(4)检测准确度和灵敏不够，因为容易受到外界物质干扰，所以检测过程容易出现假阳性和假阴性概率，导致测量结果不准确。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种深部真菌感染快速诊断试剂盒及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种深部真菌感染快速诊断试剂盒，该试剂盒中的试剂条包括pvc底板以及依次粘贴固定在所述pvc底板上的nc膜、吸水垫、结合垫和样品垫，所述结合垫的一端叠置于所述nc膜一端的上表面上，所述吸水垫叠置于所述nc膜另一端的上表面上，所述样品垫的一端叠置于所述结合垫一端的上表面上，其中，所述nc膜上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物，所述结合垫附着有g因子亚基的时间分辨荧光微球。

可选地，所述nc膜上设置有沿宽度方向平行排布的测试线和控制线，且所述控制线靠近布置所述吸水垫的一端。

可选地，所述试剂盒还包括用于容纳所述试剂条的塑料外壳，所述塑料外壳包括下壳和上壳，所述上壳上设置有加样孔和观察窗口，通过所述加样孔向所述样品垫加样，通过所述观察窗口观察所述测试线和所述控制线的变化情况。

可选地，所述结合垫的基体为玻璃纤维膜。

可选地，所述试剂条的宽度为3.5-4.5mm。

本发明另一方面提供了一种制备上述深部真菌感染快速诊断试剂盒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将(1-3)-β-d-葡聚糖与牛血清白蛋白偶联，形成(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物；

(2)将(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物溶解在包被缓冲液中，然后将所得混合物固定在nc膜上面，得到表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜；

(3)合成与(1-3)-β-d-葡聚糖特异性结合的g因子亚基；

(4)通过活化和偶联使g因子亚基与时间分辨荧光微球结合，然后喷洒到玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫；

(5)将所述表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜、吸水垫、所述结合垫、样品垫按照次序依次粘贴固定在pvc底板上，然后进行切条。

可选地，在步骤(2)中，通过喷金划膜仪将所述所得混合物固定在nc膜上面。

可选地，在步骤(3)中，所述g因子亚基的合成方法包括：

(a)从基因文库中筛选出g因子亚基基因序列；

(b)依次进行密码子优化、基因合成、亚克隆及表达载体；

(c)通过转化挑取单克隆、小试管表达、表达鉴定、表达菌株保存及放大表达、细胞收集，实现目标蛋白表达；

(d)通过细胞破碎、上清及包涵体纯化小试、亲和纯化及多步纯化摸索、蛋白鉴定及检测，获得高纯度的g因子亚基。

可选地，在步骤(4)中，通过喷金划膜仪将结合了g因子亚基的时间分辨荧光微球喷洒到玻璃纤维膜上。

可选地，所述方法还包括：将切成的试剂条按照要求装进塑料卡壳内，放在专用的铝箔袋，同时放入干燥剂和塑料滴管。

按照本发明所述的深部真菌感染快速诊断试剂盒，具有以下优点：

(1)运输和保存成本低，因为本发明为干式检测试剂，因此在常温下就可以保存，在运输过程中大大减少冷链运输成本，在保存过程中也不需要另外购买冰箱或者配置冷库，从而大大降低了能耗成本。

(2)操作简单、使用方便，本发明只需要将所有检测的血清样本滴加上试剂卡上一步操作，等待反应结束即可以获得检验结果。

(3)检测时间短、通量大，本发明检测过程只需要15min左右就可以获得结果，而且配合所用的检测仪器，一个小时可以检测180个样本。

(4)检测结果准确，因为本发明采用的是(1-3)-β-d-葡聚糖特异性结合g蛋白亚基(即g因子亚基)，所以反应过程中不会受到液体中、环境中其他类似物干扰，检测结果可靠。

(5)应用场景广，本产品因其操作简单、保存方便、不受环境影响，因此有更广的使用场景。

附图说明

图1是本发明所述的试剂盒中试剂条各部分组合示意图；

图2是本发明所述的试剂盒中试剂条检测样本反应示意图；

图3是本发明所述的试剂盒的外观结构示意图。

附图标记说明

1pvc底板2nc膜

3结合垫4吸水垫

5样品垫6控制线

7测试线10下壳

20加样孔30上壳

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

如图1和2所示，本发明所述的深部真菌感染快速诊断试剂盒包括试剂条，所述试剂条包括pvc底板1以及依次粘贴固定在所述pvc底板上的nc膜2、吸水垫4、结合垫3和样品垫5，所述结合垫3的一端叠置于所述nc膜2一端的上表面上，所述吸水垫4叠置于所述nc膜2另一端的上表面上，所述样品垫5的一端叠置于所述结合垫3一端的上表面上，其中，所述nc膜2上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物，所述结合垫3附着有g因子亚基的时间分辨荧光微球。

在本文中，“pvc底板”是指聚氯乙烯底板。

在本文中，“nc膜”是指硝酸纤维素膜。

在优选情况下，如图1和2所示，所述nc膜2上设置有沿宽度方向平行排布的测试线7和控制线6，且所述控制线6靠近布置所述吸水垫4的一端。

进一步优选地，如图3所示，所述试剂盒还包括用于容纳所述试剂条的塑料外壳，所述塑料外壳包括下壳10和上壳30，所述上壳30上设置有加样孔20和观察窗口，通过所述加样孔20向所述样品垫5加样，通过所述观察窗口观察所述测试线7(即t线)和所述控制线6(即c线)的变化情况。

在本发明中，所述结合垫3的基体优选为玻璃纤维膜，在这种情况下，所述结合垫3的结构包括玻璃纤维膜以及附着在所述玻璃纤维膜表面上的g因子亚基的时间分辨荧光微球(即结合了g因子亚基的时间分辨荧光微球)。

在本发明中，所述试剂条的宽度可以为3.5-4.5mm，最优选为4mm。

本发明还提供了制备上述深部真菌感染快速诊断试剂盒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将(1-3)-β-d-葡聚糖与牛血清白蛋白偶联，形成(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物；

(2)将(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物溶解在包被缓冲液中，然后将所得混合物固定在nc膜上面，得到表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜；

(3)合成与(1-3)-β-d-葡聚糖特异性结合的g因子亚基；

(4)通过活化和偶联使g因子亚基与时间分辨荧光微球结合，然后喷洒到玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫；

(5)将所述表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜、吸水垫、所述结合垫、样品垫按照次序依次粘贴固定在pvc底板上，然后进行切条。

在步骤(2)中，优选地，通过喷金划膜仪将所述所得混合物固定在nc膜上面。

在步骤(3)中，优选地，所述g因子亚基的合成方法包括：

(a)从基因文库中筛选出g因子亚基基因序列；

(b)依次进行密码子优化、基因合成、亚克隆及表达载体；

(c)通过转化挑取单克隆、小试管表达、表达鉴定、表达菌株保存及放大表达、细胞收集，实现目标蛋白表达；

(d)通过细胞破碎、上清及包涵体纯化小试、亲和纯化及多步纯化摸索、蛋白鉴定及检测，获得高纯度的g因子亚基。

在步骤(4)中，优选地，通过喷金划膜仪将结合了g因子亚基的时间分辨荧光微球喷洒到玻璃纤维膜上。

按照本发明所述的方法还可以包括：将切成的试剂条按照要求装进塑料卡壳内，放在专用的铝箔袋，同时放入干燥剂和塑料滴管，从而制得试剂盒产品。

下面通过阐述本发明所述的深部真菌感染快速诊断试剂盒的检测实施过程对本发明做进一步说明：

如图2和3所示，待测血清样本通过加样孔20加到所述样品垫5上，待测血清样本沿着图2中所示的层析方向进行层析，依次经过样品垫5、结合垫3、nc膜2，再通过观察窗口观察nc膜上测试线(即t线)和控制线(即c线)的变化情况，并根据观察的变化情况确定检测结果。

按照本发明的上述技术方案，其有益效果如下：

(1)运输和保存成本低，因为本发明为干式检测试剂，因此在常温下就可以保存，在运输过程中大大减少冷链运输成本，在保存过程中也不需要另外购买冰箱或者配置冷库，从而大大降低了能耗成本。

(2)操作简单、使用方便，本发明只需要将所有检测的血清样本滴加上试剂卡上一步操作，等待反应结束即可以获得检验结果。

(3)检测时间短、通量大，本发明检测过程只需要15min左右就可以获得结果，而且配合所用的检测仪器，一个小时可以检测180个样本。

(4)检测结果准确，因为本发明采用的是(1-3)-β-d-葡聚糖特异性结合g蛋白亚基(即g因子亚基)，所以反应过程中不会受到液体中、环境中其他类似物干扰，检测结果可靠。

(5)应用场景广，本产品因其操作简单、保存方便、不受环境影响，因此有更广的使用场景。

以下通过实施例和对比例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

将(1-3)-β-d-葡聚糖与牛血清白蛋白偶联，形成(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物。将(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物溶解在包被缓冲液中，然后将所得混合物固定在nc膜上面，得到表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜。

合成与(1-3)-β-d-葡聚糖特异性结合的g因子亚基，合成过程为：(a)从基因文库中筛选出g因子亚基基因序列；(b)依次进行密码子优化、基因合成、亚克隆及表达载体；(c)通过转化挑取单克隆、小试管表达、表达鉴定、表达菌株保存及放大表达、细胞收集，实现目标蛋白表达；(d)通过细胞破碎、上清及包涵体纯化小试、亲和纯化及多步纯化摸索、蛋白鉴定及检测，获得高纯度的g因子亚基。

通过活化和偶联使g因子亚基与时间分辨荧光微球结合，然后喷洒到玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫。

将所述表面上包被有(1-3)-β-d-葡聚糖和牛血清白蛋白复合物的nc膜、吸水垫、所述结合垫、样品垫按照次序依次粘贴固定在pvc底板上，然后进行切条，宽度为4mm，之后将切成的小条按照要求装进塑料卡壳内，放在专用的铝箔袋，同时放入干燥剂和塑料滴管，从而制得试剂盒。

待测血清样本通过加样孔加到样品垫上，待测血清样本沿着图2中所示的层析方向进行层析，依次经过样品垫、结合垫、nc膜，再通过观察窗口观察nc膜上测试线(即t线)和控制线(即c线)的变化情况，并根据观察的变化情况确定检测结果。采用本实施例制备的试剂盒，检测过程只需要15min左右就可以获得结果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。