一种二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极及制备方法和应用与流程

本发明涉及电分析化学领域，具体涉及一种二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极及制备方法和在检测分析复杂样品中的应用。

背景技术：

电化学传感器因其检测快速、操作简便及选择性高等特点而被广泛应用于各行各业。然而，在实际样品检测中，电化学传感器表面经常受到污染，尤其是在复杂的生物流体(如血液、血清)中，蛋白质等其他物质可能会不可逆地吸附在电极上，使其表面部分失活，同时其他共存的电活性小分子也可能干扰目标信号，这严重影响了传感器在复杂样品中检测的灵敏度、稳定性及重复性。由于不可逆的表面污染和其他电活性小分子的干扰，在复杂样品中直接进行电化学检测通常是不可行的，往往需要对样品进行分离、富集等预处理操作。

近年来的研究表明，二氧化硅纳米孔道膜(也称垂直有序介孔二氧化硅薄膜，vmsf)修饰电极可用于复杂生物、环境样品的直接电化学分析。vmsf是一种具备高度有序结构的无机二氧化硅材料，因其制备简单、制备过程低污染和可循环性好等特点，在污染物吸附、能源催化、电化学传感和分离领域得到了广泛的应用。在电化学检测过程中，具有电化学反应活性物质或检测底物可以从溶液中通过vmsf的垂直孔道到达基底电极表面，而复杂基质中的蛋白质等大分子物质由于纳米孔道的尺寸排阻作用而无法进入孔道。此外，vmsf超小的纳米孔道(直径通常为2-3nm)具有电荷排阻效应，其二氧化硅结构电离后孔道带负电荷，可以静电排阻负电性共存组分的干扰。除此之外，vmsf的纳米孔道对正电性小分子检测物具有静电吸附作用，也可以通过氢键作用等富集检测物。因此，vmsf除具有防玷污抗干扰作用外，还对正电荷或可形成氢键的小分子检测物具有一定的富集作用。

目前，基于vmsf修饰电极的电分析研究大多建立在以氧化铟锡(ito)电极作为电极基底。然而，ito对具有电化学活性的生物标志物(神经递质、氨基酸、代谢物)或药物表现出较高的过电位，而且ito易于被电化学还原，其负电位窗口受限。玻碳电极(gce)是最常用的电化学电极，具有性质稳定、电化学窗口宽、对有机电化学分子过电位低等优势，可作为惰性电极直接用于阳极溶出，阴极和变价离子的伏安测定，还可以作化学修饰电极，但是vmsf无法与gce电极稳定结合，本课题组前期研究发现直接在玻碳电极表面生长的vmsf薄膜经温和水冲洗就会快速脱落。截至目前为止，尚未有gce电极上直接生长vmsf的研究见诸报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以将二氧化硅纳米孔道膜(vmsf)稳定结合在玻碳电极上的制备方法，并将其应用于复杂样品的检测分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极的制备方法，包括以下步骤：

(1)对玻碳电极进行电化学活化，制备电化学活化的玻碳电极；

(2)在电化学活化的玻碳电极上制备二氧化硅纳米孔道薄膜，制得所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极。

电化学活化也称为电化学极化活化法，研究表明，玻碳电极经电化学活化后，不仅电化学响应的重现性得以极大地改善，同时，灵敏度和电子传导等性质也得以极大地提高，而且表现出增强吸附等一些新的特性。

步骤(1)中，所述电化学活化包括电化学氧化及随后的电化学还原两个步骤。电化学氧化的目的是在玻碳电极表面形成羧基、羰基等含氧基团，随后的电化学还原的目的是将电化学氧化产生的羰基还原为羧基。

电化学活化的介质、电化学氧化与还原的电位及时间对所得电化学活化电极的性质(如导电性、表面含氧基团尤其是羟基基团的数量等)起到关键影响。

电化学活化既可以在酸性或中性溶液中，也可以在碱性溶液中进行。采用不同的活化溶液将导致不同的电极表面。在碱性溶液中活化后，由于活化的电极表面是一个接近氧化单层的表面，电极的背景电流和表面含氧比例均变小，与之相反，在酸性或者中性溶液中活化后的电极表面存在一个多孔的氧化多层膜，从而导致电极的背景电流和表面含氧比例均显著增大。为提高表面含氧基团含量，增加玻碳电极与二氧化硅纳米孔道膜的结合力，选择的电化学活化溶液ph值为3.0～7.0，作为优选，ph值为4.0。为降低电化学活化的热效应，不宜选择过高离子强度的溶液，作为优选，选择离子浓度为0.01～0.2mol/l的溶液，更为优选，采用离子浓度为0.1mol/l的缓冲液。具体地，可采用磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠作为电化学活化的介质。

采用过高的氧化电位和氧化时间将导致玻碳电极的氧化过度进而影响电极的导电性。采用过低的氧化电位则导致过低密度的含氧基团。作为优选，先对工作电极施加1.6～1.9v的恒定电压并持续2min～6min进行电化学氧化，再施加-1.2～-0.8v的恒定电压并持续60s～3min进行电化学还原。更为优选，先对工作电极施加1.8v的恒定电压并持续5min，再施加-1.0v的恒定电压并持续60s。

为精准控制施加在工作电极上的电压，可采用三电极体系，以玻碳电极作为工作电极。

在上述条件下制得的电化学活化玻碳电极(p-gce)表面富含羟基基团，一方面可以提高玻碳电极的亲水性，另一方面可以通过氢键等作用富集检测物质。

步骤(2)中，采用溶液生长法或电化学辅助自组装法制备二氧化硅纳米孔道薄膜。

所述溶液生长法采用如四乙氧基硅氧烷(teos)等硅氧烷作为硅源，以表面活性剂(如十六烷基三甲基溴化铵-ctab)胶束(sm)作为软模板。在氨水和乙醇的反应介质中，表面活性剂组装成球形胶束。当在溶液中加入电极时，由于玻碳电极表面羟基的微弱电离产生的负电荷可以静电吸附表面活性剂胶束，从而诱导胶束从球形向圆柱状转化。硅源在基底电极与胶束外围空隙处生长，最终复制胶束的结构，形成具有垂直纳米孔结构的薄膜层。采用盐酸-乙醇溶液去除胶束后，形成具有垂直开放孔道的vmsf。

所述电化学辅助自组装法的原理和过程为：首先将以一定比例硅源及表面活性剂混合并在ph为3.0的条件下进行预水解制得前驱体溶液。随后将基底电极浸入前驱体溶液中，并在电极上施加一个负电位。在这一过程中，表面活性剂胶束会在负电性的电极表面发生自组装，同时电极上的负电压使得水会在电极表面发生电化学分解反应，产生oh-，oh-会催化硅源的缩聚过程，最终在电极表面形成具有垂直六方形孔道的介孔二氧化硅纳米孔道膜。

研究表明，电化学活化玻碳电极上生长的vmsf可以稳定存在，这归因于电化学活化使得玻碳电极表面产生大量的羟基。电化学活化玻碳电极表面羟基基团具有两个突出的作用：一是可以通过微弱电离产生负电荷并通过静电吸附使表面活性剂胶束从球形向圆柱形转化；二是可以参与硅烷的溶胶-凝胶反应并形成共价键，从而稳定二氧化硅纳米孔道薄膜在玻碳电极上的结合。因此，介孔二氧化硅纳米孔道膜可以稳定地结合在玻碳电极表面。

本发明提供了一种由上述方法制备得到的二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极。其中电化学活化的玻碳电极基底可以通过π-π作用、氢键作用等富集有机电活性分子，较未活化的玻碳电极具有更高的电化学信号和更好的电位分辨能力。二氧化硅纳米孔道膜，孔道结构均一、排列有序，孔径大小为2～3nm，具有显著的尺寸排阻和电荷排阻效应，可以有效降低或去除复杂样品基质中的蛋白质、颗粒等杂质对电极表面的玷污，又可以降低共存负电性组分的电化学干扰，在复杂样品无需样品前处理的直接检测中具有潜力。

本发明提供了所述的二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在制备检测多巴胺、尿酸、去甲肾上腺素或色氨酸的电化学检测试剂盒中的应用，所述试剂盒包括以二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极作为工作电极的三电极体系和样品稀释液。

由于介孔二氧化硅纳米孔道可以通过氢键作用富集检测物，其电负性可以通过静电作用富集正电性检测物，此外电化学活化的玻碳电极也可以通过静电作用、π-π作用、氢键作用等对上述检测物实现预富集作用，因此可显著提高二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极对待测物的检测性能。

根据目标检测物的特性选择合适的样品稀释液，比如：多巴胺在碱性条件下容易发生氧化自聚而生成聚多巴胺，因此选择ph值≤6.5的样品稀释液。尿酸的pka为5.8，当溶液ph值大于5.8时，尿酸荷负电，会与介孔二氧化硅纳米孔道膜产生静电排斥作用，从而降低检测性能，因此选择ph值≤5.8的样品稀释液；同理，检测去甲肾上腺素(pka为8.6)时，选择ph值≤8.6的样品稀释液，检测色氨酸(pka为5.9)时，选择ph值≤5.9的样品稀释液。

具体地，本发明提供了所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在电化学检测血清样品中多巴胺、尿酸、去甲肾上腺素和色氨酸中的应用。

血清是复杂的生物流体，具有大量的蛋白质等共存组分，基质十分复杂。利用常规的电化学电极对血清样品进行电化学检测时，由于蛋白质等物质会通过非特异性吸附作用吸附到电极表面，进而玷污电极表面，影响电化学电极检测的重现性和准确性。此外，共存的电化学组分也会产生干扰信号。而本发明提供的二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极具有防玷污、抗干扰作用，对于血清样品检测，无需样品前处理可直接检测。

所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在电化学检测待测样品中的多巴胺时，包括以下步骤：

a、将待测样品用ph值为3.0～6.5的缓冲溶液稀释后得到待测液；

b、采用三电极体系，以二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于待测液中，采用差分脉冲伏安法测得多巴胺的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.35v；根据标准曲线计算待测样品中的多巴胺含量。

由于多巴胺在碱性条件下容易发生氧化自聚而生成聚多巴胺，而过酸的环境容易使得血清中的蛋白质聚集产生沉淀，因此选择ph值为3.0～6.5的缓冲溶液。以差分脉冲伏安法测得多巴胺的氧化峰峰电位为0.2v，为了得到完整的氧化峰，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.35v。

利用上述方法可准确检测出血清中的多巴胺含量，多巴胺的检测范围为50nmol/l～20μmol/l。

所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在电化学检测待测样品中的尿酸时，包括以下步骤：

a、将待测样品用ph值为3.0～5.8的缓冲溶液稀释后得到待测液；

b、采用三电极体系，以二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于待测液中，采用差分脉冲伏安法测得尿酸的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.6v；根据标准曲线计算待测样品中的尿酸含量。

以差分脉冲伏安法测得尿酸的氧化峰峰电位为0.35v，为得到完整的氧化峰，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.6v。

利用上述方法可准确检测出血清中的尿酸含量，尿酸的检测范围为20nmol/l～30μmol/l。

所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在电化学检测待测样品中的去甲肾上腺素时，包括以下步骤：

a、将待测样品用ph值为3.0～8.6的缓冲溶液稀释后得到待测液；

b、采用三电极体系，以二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于待测液中，采用差分脉冲伏安法测得去甲肾上腺素的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.45v；根据标准曲线计算待测样品中的去甲肾上腺素含量。

以差分脉冲伏安法测得去甲肾上腺素的氧化峰峰电位为0.3v，为得到完整的氧化峰，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.45v。

利用上述方法可准确检测出血清中的去甲肾上腺素含量，去甲肾上腺素的检测范围为25nmol/l～20μmol/l。

所述二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极在电化学检测待测样品中的色氨酸时，包括以下步骤：

a、将待测样品用ph值为3.0～5.9的缓冲溶液稀释后得到待测液；

b、采用三电极体系，以二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于待测液中，采用差分脉冲伏安法测得色氨酸的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0.3v，终止电位为1.0v；根据标准曲线计算待测样品中的色氨酸含量。

以差分脉冲伏安法测得色氨酸的氧化峰峰电位为0.7v，为得到完整的氧化峰，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为1.0v。

利用上述方法可准确检测出血清中的色氨酸含量，色氨酸的检测范围为80nmol/l～15μmol/l。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明利用电化学活化法预处理玻碳电极，首次实现了在玻碳电极表面生长稳定的介孔二氧化硅纳米孔道膜。

(2)由于介孔二氧化硅纳米孔道可以通过氢键作用富集检测物，同时具有电负性可以通过静电作用富集正电性检测物，此外电化学活化的玻碳电极也可以通过静电作用、π-π作用、氢键作用等对检测物实现预富集作用，显著提高二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极对待测物的检测灵敏度。结合介孔二氧化硅纳米孔道的防玷污/抗干扰能力，本发明提供二氧化硅纳米孔道膜修饰玻碳电极可以应用于复杂样品中多类活性组分的直接、高灵敏电化学检测，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为玻碳电极(a)、电化学氧化后玻碳电极(b)及电化学活化后玻碳电极(c)的高分辨c1sx射线光电子能谱。

图2为玻碳电极(a)、电化学氧化玻碳电极(b)、电化学活化玻碳电极(c)在铁氰化钾溶液中的循环伏安图。

图3为电化学活化ph(a)、氧化电压(b)、氧化时间(c)对所得电化学活化电极对尿酸响应信号的影响。

图4为玻碳电极(a)、电化学活化后玻碳电极(b)在磷酸缓冲液中的循环伏安图。

图5为玻碳电极及电化学活化后玻碳电极在1mmol/l抗坏血酸、10μmol/l多巴胺、25μmol/l尿酸溶液中(缓冲介质为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，ph6.0)的微分脉冲伏安图。

图6为玻碳电极(左)和电化学活化玻碳电极(右)在生长vmsf前(a)、生长vmsf后(b)及随后用水冲洗(c)和胶束提取后(d)的照片。

图7为vmsf的透射电镜图像，(a)为俯视图，(b)为截面图，插图是相应的高分辨透射电镜图像。

图8为电化学活化gce电极(上线)、vmsf/电化学活化gce电极(中线)及gce电极(下线)在10μmol/l多巴胺(a)、50μmol/l尿酸(b)、50μmol/l去甲肾上腺素(c)和50μmol/l色氨酸(d)溶液中(缓冲介质为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，ph6.0)的循环伏安图，内插图为微分脉冲伏安图。

图9为vmsf/电化学活化玻碳电极检测血清中不同浓度多巴胺的微分脉冲伏安图(a)和线性检测曲线(b)，内插图为低浓度部分的放大曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

对比例1

采用电化学辅助自组装法，制备vmsf/gce电极。

(a)配制前驱体溶液：在40ml0.1mnano3-乙醇溶液(v/v,1:1)中加入0.34mol/lteos和0.11mol/lctab，用hcl调节溶液ph至3，在室温下缓慢搅拌2.5h得到前驱体溶液。

(b)制备vmsf/gce电极：采用三电极体系，以gce电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，对gce电极施加一个恒定的电流(80μa)，持续时间5s。结束后将电极迅速取出并用大量去离子水冲洗，所得电极在130℃下老化过夜后在0.1mhcl-乙醇溶液中磁力搅拌10min得到vmsf/gce电极。

实施例1

1、电化学活化p-gce的制备

采用三电极体系，以gce为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极。将电极体系置于0.1mol/l、ph值为4.0的磷酸缓冲液中，对gce施加1.8v的恒定电压并持续5min进行电化学氧化，再施加-1.0v的恒定电压并持续60s进行电化学还原，制得p-gce。

2、vmsf/p-gce的制备

采用电化学辅助自组装法，以p-gce为基底制备得到vmsf/p-gce电极。

(a)配制前驱体溶液：在40ml0.1mnano3-乙醇溶液(v/v,1:1)中加入0.34mol/lteos和0.11mol/lctab，用hcl调节溶液ph至3，在室温下缓慢搅拌2.5h得到前驱体溶液。

(b)制备vmsf/p-gce电极：采用三电极体系，以p-gce为工作电极，铂电极为对电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，对p-gce施加一个恒定的电流(80μa)，持续时间5s。结束后将电极迅速取出并用大量去离子水冲洗，所得电极在130℃下老化过夜后在0.1mhcl-乙醇溶液中磁力搅拌10min得到vmsf/p-gce电极。

3、表征

对对比例1、实施例1中制备的gce、p-gce、vmsf/gce、vmsf/p-gce进行x射线光电子能谱、透射电子显微镜、电化学等表征。所得测试结果如图1-9所示。

用x射线光电子能谱(xps)表征电化学活化对玻碳电极表面化学的影响。图1为玻碳电极(a)、电化学氧化后玻碳电极(b)及电化学活化后玻碳电极(c)的高分辨c1sx射线光电子能谱。gce的高分辨率c1s光谱揭示了四种碳键类型，包括c-c(284.6ev)、c-o(286.7ev)、c＝o(287.1ev)和o–c＝o(288.7ev)(图1a)。电化学氧化导致c＝o和o-c＝o的增加，c-c和c-o(图1b)的减少，表明gce表面的氧化。在随后的电化学还原之后，c-o的丰度随着c＝o的消失和c-c和o-c＝o之间的比例几乎不变而大幅度增加，这表明c＝o还原为c-o(图1c)。

图2为玻碳电极(a)、电化学氧化玻碳电极(b)、电化学活化玻碳电极(c)在铁氰化钾溶液中的循环伏安图。可以看出电化学氧化导致电极导电性显著降低，经随后的电化学还原所得的电化学活化电极具有显著提高的电流信号。证明电化学活化过程提高了电极的性能。

图3为电化学活化ph(a)、氧化电压(b)、氧化时间(c)对所得电化学活化电极性能的影响。以尿酸在电极上的响应作为标准进行比较。可以看出，电化学活化ph、氧化电压、氧化时间显著影响所得电化学活化电极对尿酸响应信号的影响。这表明，电化学活化条件将显著影响所得电极的性能。

图4为玻碳电极(a)、以及实施例1中制备电化学活化后玻碳电极(b)在磷酸缓冲液中的循环伏安图。与玻碳电极相比，电化学活化后玻碳电极显示出明显的氧化还原峰，这由电化学活化后电极表面产生的含氧基团导致。

图5为玻碳电极及电化学活化后玻碳电极在1mmol/l抗坏血酸、10μmol/l多巴胺、25μmol/l尿酸溶液中(缓冲介质为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，ph6.0)的微分脉冲伏安图。可以看出，玻碳电极无法区分抗坏血酸、多巴胺和尿酸。而与玻碳电极相比，电化学活化玻碳电极具有更好的电位分辨能力，可以区分抗坏血酸、多巴胺和尿酸。此外，电化学活化玻碳电极具有更高的电流信号。这一结果表明，电化学活化不仅提高了玻碳电极对有机电化学分子的电流响应，也增加了电位分辨能力。

图6为玻碳电极(左)和电化学活化玻碳电极(右)在生长vmsf前(a)、生长vmsf后(b)及随后用水冲洗(c)和胶束提取后(d)的照片。可以看出玻碳电极和电化学活化玻碳电极均具有强烈的镜面反光作用的黑色表面，vmsf的成功生长可以通过完全覆盖在电极表面的浅灰色层的出现证明。但即使在温和的水洗过程中，vmsf膜也会从玻碳电极表面上脱落，说明结合力差，无法稳定存在。相比之下，电化学活化玻碳电极上生长的vmsf膜在水洗和胶束去除后均保持完整。

图7为vmsf的透射电镜图像，插图是相应的高分辨透射电镜图像，(a)为俯视图，(b)为截面图。可以看出，vmsf具有六角排列的介孔纳米通道，直径约2.7nm。所制备的vmsf是一种均匀的薄膜，在大面积上没有缺陷。横截面图显示厚度约为110nm，纳米通道完全垂直于电极表面。纳米通道的密度约为7.5×10¹²/cm²，孔隙率约为43％。

多巴胺(一种神经递质)、尿酸(一种代谢物)、去甲肾上腺素(激素)和色氨酸(一种氨基酸)是四种常见的生物标志物。图8为电化学活化gce电极(上线)、vmsf/电化学活化gce电极(中线)及gce电极(下线)在10μmol/l多巴胺(a)、50μmol/l尿酸(b)、50μmol/l去甲肾上腺素(c)和50μmol/l色氨酸(d)溶液中(缓冲介质为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液，ph6.0)的循环伏安图，内插图为微分脉冲伏安图。与玻碳电极相比，电化学活化玻碳电极的阳极峰值电流显著增加(多巴胺为119倍，尿酸为29倍，去甲肾上腺素为63倍，色氨酸为23倍)，表明电化学活化的玻碳电极能显著提高其电化学性能。这种信号增强可能源于以下机制：i)通过电极表面引入的含氧基团(例如，通过氢键)改善与检测物的相互作用；ii)电化学腐蚀作用产生的丰富的边缘平面与氧相关的缺陷，可以用作电催化位点。与电化学活化玻碳电极相比，vmsf/电化学活化玻碳电极虽然有效电极面积大大减小(vmsf孔隙率估计值为43％)，但电流仅略有减小。实际上，vmsf/电化学活化玻碳电极显示了三个电极中最高的电流密度(电流值/有效电极面积，与玻碳电极上的电流密度相比，4种物质在vmsf/电化学活化玻碳电极上的电流密度对多巴胺增加243倍，对尿酸增加57倍，对去甲肾上腺素增加140倍，对色氨酸增加35倍)。这些结果证实了vmsf纳米通道也可富集分析物。这种信号增敏作用可能是通过静电作用或氢键作用产生的信号放大。

实施例2

1、da标准曲线的建立

(a)配置标准溶液：用ph6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释血清50倍，并配置一系列da标准溶液；

(b)以实施例1制备所得vmsf/p-gce为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于ph值6.0的含有多巴胺的血清溶液中，采用差分脉冲伏安法测得多巴胺的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.35v；

(c)根据多巴胺浓度与氧化信号强度的关系建立标准曲线。

图9为vmsf/p-gce检测血清中不同浓度多巴胺的微分脉冲伏安图(a)和线性检测曲线(b)，内插图为低浓度部分的放大曲线。多巴胺的检测范围为50nmol/l～20μmol/l，其dpv峰电流与多巴胺浓度呈两段线性关系，分别为50nmol/l～1.0μmol/l和1.0μmol/l～20μmol/l。所得检出限为20nmol/l。

实施例3

1、尿酸标准曲线的建立

(a)配置标准溶液：用ph5.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释血清50倍，并配置一系列尿酸标准溶液。

(b)以实施例1制备所得vmsf/p-gce为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于(a)步骤制备所得含有尿酸的血清溶液中，采用差分脉冲伏安法测得尿素的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.6v；

(c)根据尿酸浓度与氧化信号强度的关系建立标准曲线，尿酸的检测范围为20nmol/l～30μmol/l，其dpv峰电流与尿酸浓度呈两段线性关系，分别为20nmol/l～2.0μmol/l和2.0μmol/l～30μmol/l。所得检出限为12nmol/l。

实施例4

1、去甲肾上腺素标准曲线的建立

(a)配置标准溶液：用ph7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释血清50倍，并配置一系列去甲肾上腺素标准溶液。

(b)以实施例1制备所得vmsf/p-gce为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于(a)步骤制备所得含有去甲肾上腺素的血清溶液中，采用差分脉冲伏安法测得去甲肾上腺素的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0v，终止电位为0.45v；

(c)根据去甲肾上腺素浓度与氧化信号强度的关系建立标准曲线，去甲肾上腺素的检测范围为25nmol/l～20μmol/l，其dpv峰电流与去甲肾上腺素浓度呈两段线性关系，分别为25nmol/l～2.0μmol/l和2.0μmol/l～20μmol/l。所得检出限为9nmol/l。

实施例5

1、色氨酸标准曲线的建立

(a)配置标准溶液：用ph4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释血清50倍，并配置一系列色氨酸标准溶液。

(b)以实施例1制备所得vmsf/p-gce为工作电极，铂片电极为对电极，饱和银/氯化银电极为参比电极，将电极体系置于(a)步骤制备所得含有色氨酸的血清溶液中，采用差分脉冲伏安法测得色氨酸的氧化信号，所述的差分脉冲伏安法的起始电位为0.3v，终止电位为1.0v；

(c)根据色氨酸浓度与氧化信号强度的关系建立标准曲线，色氨酸的检测范围为80nmol/l～15μmol/l。所得检出限为35nmol/l。

上述实施例仅为本发明的较佳实施例，而非全部。本领域中技术人员基于本发明的简单修饰、替代、简化均包括在本发明的保护范围内。