一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法与流程

本发明涉及药材质量控制技术领域，尤其涉及一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法。

背景技术：

本品为木犀科植物连翘forsythiasuspensa(thunb.)vahl的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。分布于河北、山西、陕西、甘肃、宁夏、山东、江苏、河南、江西、湖北、四川及云南等省区。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，用于治疗痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热人营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等证。药理研究表明连翘具有良好的抗菌作用，连翘酯苷、连翘苷等均有很强的抗菌活性，连翘还具有抗病毒作用，同时还有解热、抗炎以及肝脏保护等作用。《中国药典》(2015年版)对连翘药材中连翘苷和连翘酯苷a的含量进行了控制。文献报道采用hplc法测定连翘中连翘苷、连翘酯苷a和芦丁的含量，采用比色法测定总黄酮的含量，亦有釆用hplc指纹图谱的技术评价连翘药材质量的报道。

《中国药典》(2015年版)规定本品含连翘苷(c27h34o17)不得少于0.15％，含连翘酯苷a(c29h36o15)不得少于0.25％。参考图10，由于指标含量范围较为广泛，这将为产品的质量稳定均一和临床安全有效性带来很大的隐患，需要更加严格控制药材的质量。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中指标含量范围较为广泛，将为产品的质量稳定均一和临床安全有效性带来很大隐患的缺点，而提出的一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，包括以下步骤：

步骤一对照品溶液制备

准确称量2.00mg的对照品，分别置于10ml量瓶中，加入适量50％甲醇溶解，并以50％甲醇定容，得到质量浓度为200μg/ml的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用50％甲醇稀释10倍，上述对照品为连翘酯苷a(111831-200803)，连翘苷110809-200604)，(+)-表松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷，(+)-松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷；

步骤二供试品溶液制备

取连翘药材粉碎过40目筛，取粉末约1g，精密称定，加入70％甲醇25ml置圆底烧瓶中，称定重量，回流提取30分钟，冷却至室温，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

步骤三化合物测定

通过hplc-tof/ms正负总离子流色谱图检测对照品溶液、供试品溶液，进行对比分析得出结果；

步骤四指纹图谱的测定

取多批连翘药材作为样本进行指纹图谱研究，将多批药材的指纹图谱的aia数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004a版相似度软件，以其中一批连翘药材的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.10，多点校正后，确定主要的色谱特征峰，选取峰面积较大、出峰时间适中且稳定的连翘酯苷a峰作为参照峰，计算各色谱峰相对于其的峰面积比，若某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的色谱峰数；

步骤五聚类分析

将各色谱峰占总色谱峰的峰面积量化，得到原始数据矩阵，运用“spss软件”对其进行聚类分析，聚类分析将连翘样品分为ⅰ类和ⅱ类；

步骤六指纹图谱建立

根据多批连翘药材的聚类分析结果，从中选取归属于ⅰ类的多批药材的色谱图生成指纹图谱及对照指纹图谱，计算相似度；

步骤七色谱峰的指认

采用对照品结合液质联用法对连翘指纹图谱中的主要特征峰进行指认。

优选的，步骤三中：

色谱条件为：色谱柱：orcac185μ250*4.6mm；检测波长：230nm；柱温：35℃。流速：1ml/min；流动相：a-乙腈，b-0.05％磷酸；洗脱方式：梯度洗脱0～15min，5％～15％a，15～65min，15％～40％a，65～80min，40％a～100％a；进样量：5μl；

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4。tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

优选的，步骤七中：

对照品法：制备芦丁、连翘酯苷a、连翘苷混合对照品溶液，按连翘指纹图谱方法测定，进行比对；

hplc-q-tof法

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

本发明提出的一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，有益效果在于：建立了连翘hplc指纹图谱质量评价方法，建立了连翘hplc指纹图谱的共有模式，作为连翘的质量控制指标。采用连翘hplc指纹图谱质量评价体系对14批次连翘样品进行评价，结果表明连翘质量存在差异，个别批次质量较差。本研究建立的连翘指纹图谱方法稳定、可靠、重现性好，可为连翘药材的质量评价提供依据。

附图说明

图1为本发明的精密度试验的hplc色谱图；

图2为本发明的稳定性试验的hplc色谱图；

图3为本发明的重复性试验的hplc色谱图；

图4为本发明的14批次连翘药材hplc指纹图谱；

图5为本发明的连翘药材聚类分析图；

图6为本发明的连翘药材hplc指纹图谱；

图7为本发明的生成的对照指纹图谱；

图8为本发明的连翘药材与混合对照比对图谱；

图9为本发明的连翘药材的供试品hplc-tof/ms正负总离子流色谱图；

图10为按《中国药典》(2015年版)连翘药材含量测定方法进行测定连翘药材中连翘苷、连翘酯苷a含量柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1-9，一种连翘指纹图谱质量控制体系的建立方法，包括，包括以下步骤：

步骤一对照品溶液制备

准确称量2.00mg的对照品，分别置于10ml量瓶中，加入适量50％甲醇溶解，并以50％甲醇定容，得到质量浓度为200μg/ml的对照品贮备液，进样前将对照品贮备液用50％甲醇稀释10倍，上述对照品为连翘酯苷a(111831-200803)，连翘苷110809-200604)，(+)-表松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷，(+)-松脂素-4-o-β-d-葡萄糖苷；

步骤二供试品溶液制备

取连翘药材粉碎过40目筛，取粉末约1g，精密称定，加入70％甲醇25ml置圆底烧瓶中，称定重量，回流提取30分钟，冷却至室温，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得；

步骤三化合物测定

通过hplc-tof/ms正负总离子流色谱图检测对照品溶液、供试品溶液，进行对比分析得出结果；

色谱条件为：色谱柱：orcac185μ250*4.6mm；检测波长：230nm；柱温：35℃。流速：1ml/min；流动相：a-乙腈，b-0.05％磷酸；洗脱方式：梯度洗脱0～15min，5％～15％a，15～65min，15％～40％a，65～80min，40％a～100％a；进样量：5μl；

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4。tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

精密度试验：

取连翘粉末约1g，精密称定，按样品制备方法制备连翘药材供试品溶液,在确定的色谱条件下测定,连续进样6次，测定hplc色谱图，以7号峰连翘酯苷a的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。精密度试验的hplc色谱图见图1，精密度试验数据见表1、2，可见，各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％，符合指纹图谱的要求。

表1精密度试验相对保留时间数据

表2精密度试验相对峰面积数据

稳定性试验考察

取精密度下的供试品溶液,密闭,放置于室温,分别在0，3，6，9，12，24h时间间隔下检测指纹图谱，以7号峰连翘酯苷a的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。稳定性试验的hplc色谱图见图2及表3、4。数据表明各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％,符合指纹图谱的要求。说明供试品溶液在24h内稳定。

表3稳定性试验相对保留时间数据

表4稳定性试验相对峰面积数据

重复性试验：

按确定的供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液,在确定的色谱条件下测定,记录色谱图，以7号峰连翘酯苷a的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。重复性试验的hplc色谱图见图3，重复性试验结果见表5、6，各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的rsd值均小于5％,符合指纹图谱的要求。

表5重复性试验相对保留时间数据

表6重复性试验相对峰面积数据

步骤四指纹图谱的测定

取14批连翘药材作为样本进行指纹图谱研究，将14批药材的指纹图谱的aia数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004a版相似度软件，以表14中l1号连翘药材的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.10，多点校正后，确定了10个主要的色谱特征峰。选取峰面积较大、出峰时间适中且稳定的7号峰连翘酯苷a峰作为参照峰，计算各色谱峰相对于其的峰面积比。若某一指纹图谱在某相对保留时间处无峰，相对峰面积为零，仍给相应的编号，以保证各色谱指纹图谱都有相同的色谱峰数。数据见表7，图4；

表714批次连翘指纹图谱数据

步骤五聚类分析

将各色谱峰占总色谱峰的峰面积量化，得到14x10阶原始数据矩阵，运用“spss软件”对其进行聚类分析。聚类分析将14个连翘样品分为2大类，可判定连翘内在质量具有差异性。分类聚类谱系图见图5。14批样品分为两类，样品号为1、2、3、5、6、9、10、11、13、14的样品属于ⅰ类，样品号为4、7、8、12的样品属于ⅱ类；

步骤六指纹图谱建立

根据对14批连翘药材的聚类分析结果，从中选取归属于ⅰ类的10批药材的色谱图生成指纹图谱及对照指纹图谱，相似度计算结果表8，图6、7；

表810批次连翘药材相似度评价结果

由相似度评价结果可以看出，各批连翘与对照指纹图谱间的相似度为0.999～0.990，符合指纹图谱技术要求。

相似度分析

利用国家药典委员会2004b版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算软件，对上述14批样品与对照指纹图谱进行匹配，进行相似度评价，结果见表9。结果表明各批连翘药材与对照指纹图谱间的相似度为0.998～0.987，表明各批次药材之间具有较好的一致性，本方法可用于综合评价连翘药材的整体质量。

表9连翘药材14批次相似度评价

相似度评价结果表明药材连翘的hplc色谱图差异不大,但是通过聚类分析可以看到，不同批次的连翘在主要成分含量上有一定差别,并根据这种差别可以将其分为两大类。

步骤七色谱峰的指认

采用对照品结合液质联用法对连翘指纹图谱中的主要特征峰进行指认。

对照品法：制备芦丁、连翘酯苷a、连翘苷混合对照品溶液，按连翘指纹图谱方法测定，进行比对，见图8；

hplc-q-tof法

质谱条件：hplc条件如前所述，分流比设为1:4，tof-ms实验条件：正负离子分别进行全扫描(esi)，扫描质量范围50～1200da；干燥气的体积流量6l/min，干燥气温度180℃，雾化气压0.8bar，阳离子模式下，毛细管电压4500v，阴离子模式下的毛细管电压2600v，碎裂电压200vpp，选择甲酸钠溶液为内标矫正。

参考图9，由hplc-tof/ms正负总离子流色谱图，分析识别指纹图谱中主要特征峰结构为：3,4-dihydroxyphenylethanoidglycoside、β-羟基连翘酯苷a、连翘酯苷j、2-methoxy-3,4,5-trihydroxyphenylethanoidglycoside、连翘酯苷a、β-羟基连翘酯苷i、β-coumaroyl-(6-o-caffeoyl)-glucoside、芦丁、连翘苷、松脂素-4′-β-葡萄糖苷。

建立了连翘hplc指纹图谱质量评价方法，建立了连翘hplc指纹图谱的共有模式，作为连翘的质量控制指标。采用连翘hplc指纹图谱质量评价体系对14批连翘样品进行评价，结果表明连翘质量存在差异，个别批次质量较差。本研究建立的连翘药材指纹图谱方法稳定、可靠、重现性好，可为连翘药材的质量评价提供依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变而得到的技术方案、构思、设计，都应涵盖在本发明的保护范围之内。