用于诊断结核性胸膜炎的胸水外泌体代谢物组合、试剂盒及方法与流程

本发明涉及结核性胸膜炎诊断方法，具体涉及一种用于诊断结核性胸膜炎的胸水外泌体代谢物组合、试剂盒及方法。

背景技术：

结核性胸膜炎是临床上常见的肺外结核病，发病率较高，约占整个胸膜疾病的44.1％，而在我国恶性胸膜炎发病率约高达90万/年，约占世界总发病的9％。肺癌的发病率和致死率是世界最高的肿瘤之一，而约40％的肺癌患者在疾病过程中会出现恶性胸腔积液。目前，由于诊断技术限制，两者确诊比例非常低。但结核性胸膜炎与恶性胸膜炎的预后和治疗完全不同，若得不到及时诊断和治疗，将直接影响患者的生活质量和生存。因此如何快速、准确的鉴别良恶性胸膜炎是当前临床研究的热点和难点。

目前临床上诊断和鉴定结核性胸膜炎和恶性胸膜炎的方法包括临床表现、胸腔穿刺的化验结果、胸膜活检、气管镜、外科活检等，其中最常用的方法是采用胸腔穿刺进行细胞学检查，如果在胸腔积液中发现肿瘤细胞对恶性胸膜炎有确诊价值，但由于胸腔积液中细胞成分复杂，有时肿瘤细胞与炎性间皮细胞、巨噬细胞等难以鉴别，同时还受诊断者水平和样本采集等因素的影响，其敏感性较低(约40％-60％)，主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊；而结核性胸膜炎的诊断主要包括胸水生化检查、结核菌素皮试(tst)、胸腔积液细菌学检查(抗酸染色涂片和结核分枝杆菌培养)、胸膜组织病理活检等。但上述检查方法特异性和敏感性均较低，并且有些方法创伤大、风险高、或者时间周期长，不能满足临床工作需要，因此发展新型高灵敏的胸膜炎诊断技术具有十分重要的临床意义。

外泌体(microparticles，mps)是机体在应激时，细胞以脂质双分子层结构包裹胞浆中物质分泌到细胞外的亚细胞成分，包含多种rna、蛋白质、脂质等活性物质，其粒径主要分布在30-150nm。大量研究证实外泌体是细胞间重要的信息和物质载体，具有调控细胞通讯、细胞生长、细胞迁徙、血管新生及免疫反应等功能。值得注意的是，由于外泌体具有稳定的双膜结构可以保持其完整性，甚至能富集一些重要生物活性物质，因此，近年来外泌体被认为是一种理想的疾病诊断生物标志物载体，具有较高的稳定性、特异性和敏感性，可为疾病的早期诊治带来新的希望。鉴于此，检测胸水外泌体中小分子代谢物的变化有助于我们了解结核性胸膜炎的代谢谱，以便开发和建立更有效的结核性胸膜炎诊断方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于诊断结核性胸膜炎的胸水外泌体代谢物组合、试剂盒及方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

用于诊断结核性胸膜炎的胸水外泌体代谢物组合，包括二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸。

进一步的，用于诊断结核性胸膜炎的试剂盒，包括用于检测胸水外泌体样品提取溶液中二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸的浓度所需的内标物。

采用液相色谱质谱联用技术，所述内标物为d5-苯丙氨酸、d3-十六酰基肉碱、磷脂酰胆碱38:0、磷脂酰乙醇胺34:0、鞘磷脂d30:1和d3-硬脂酸。

进一步的，所述试剂盒用于对受试者的胸水外泌体样品提取溶液进行检测，检测时胸水外泌体样品提取溶液中d5-苯丙氨酸的浓度为3.6ug/ml，d3-十六酰基肉碱的浓度为0.15ug/ml，磷脂酰胆碱38:0的浓度为0.625ug/ml，磷脂酰乙醇胺34:0的浓度为0.75ug/ml，鞘磷脂d30:1的浓度为0.125ug/ml，d3-硬脂酸的浓度为2.5ug/ml。

用于诊断结核性胸膜炎的方法，包括以下步骤：

步骤1、取受试者胸水外泌体样品提取溶液，检测得到提取液中的二甲基甘氨酸浓度值a、鞘磷脂28:1浓度值b、磷脂酰胆碱35:6浓度值c、磷脂酰乙醇胺33:2浓度值d、酰基肉碱10：2浓度值e、胆碱浓度值f、油酸浓度值g和磷脂酰胆碱o-36:0浓度值h，浓度值单位为ug/ml；

步骤2、计算结核性胸膜炎概率prob，若prob＜0.5，则判断受试者患有结核性胸膜炎，所述结核性胸膜炎概率的计算方法为：prob＝1/(1+e^-x)，其中x＝-1077.430a-2271.354b+113.216c+171.777d-35374.848e+231.376f-19.951g-43.409h+638.529。

本发明的有益效果为：胸水外泌体中代谢物二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸可以联合用于结核性胸膜炎病人的识别。通过本发明涉及的组合标志物，能够对结核性胸膜炎的诊断具有高灵敏、高特异性特征。同时，该组合标志物可以与传统的标志物腺甙脱氨酶互补，联合使用能够用于结核性胸膜炎的辅助诊断。

附图说明

图1、二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1、油酸在结核性胸膜炎和恶性胸膜炎胸水外泌体中的含量变化(均值±标准误差表示)。

图2、联合标志物及其单个标志物在判别结核性胸膜炎组和恶性胸膜炎胸组的roc曲线；

图3、联合标志物和ada在判别结核性胸膜炎组和恶性胸膜炎胸组的诊断正确率比较图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明确定的8种小分子代谢物：二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸都是人体中重要的小分子代谢物。本发明首次将以上八种代谢物组合并应用在结核性胸膜炎的诊断，该组合的质谱靶向分析离子信息如下表1所示。

表1.八种组合标志物的靶向分析的信息表。

根据该试剂盒的检测方法如下：

(1)胸水样本预处理方法：

胸水样在4℃下解冻，胸水样品依次通过10分钟500×g和20分钟2000×g离心，分别去除胸水中细胞、细胞碎片。然后上清液通过60-90分钟20000×g离心去除胸水中微颗粒等，然后上清液通过60-90分钟110000×g离心获得外泌体沉淀，用1mlpbs重悬外泌体沉淀样品，再经过60-90分钟110000×g离心获得外泌体沉淀样品，最后150μlpbs重悬外泌体沉淀样品，取其100μl，加入400μl含有多个内标的甲醇提取液沉淀蛋白：涡旋30-90s，静置15-30mins后，4℃条件下10000-14000×g转速离心10-15mins，取上清冷冻干燥；加入50ul10-20％(v/v)甲醇水溶液，4℃条件下10000-14000×g转速离心10-15mins，取上清进行lc-ms/ms分析。

(2)液相色谱质谱联用方法靶向检测目标代谢物方法：

分离系统为超高效液相色谱，色谱柱为c8，流动相流速为0.2-0.35ml/min，柱温为40-60摄氏度，进样量为5-10ul(也可使用c18色谱柱，柱温为40-60摄氏度，流速为0.2-1.0ml/min)；洗脱液为a相0.1％(v/v)甲酸的水溶液、b相0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液(也可以选择0-0.1％(v/v)甲酸的水溶液和乙腈(甲醇)溶液洗脱液，但灵敏度相对要低些)；内标通常选择为同位素也可采用其他质谱检测常用内标等。检测器采用的质谱为高灵敏度的单四级杆质谱或串联四级杆质谱(q-trapms、qqqms)，正、负离子模式检测。该组合的质谱靶向分析离子信息如表1所示。

(3)基于质谱检测数据的判断模型：

所获得数据通过spss软件进行二元逻辑回归分析，所建模型获得的回归方程如下：

x＝-1077.430×二甲基甘氨酸浓度值-2271.354×鞘磷脂28:1浓度值+113.216×磷脂酰胆碱35:6浓度值+171.777×磷脂酰乙醇胺33:2浓度值-35374.848×酰基肉碱10：2浓度值+231.376×胆碱浓度值-19.951×油酸浓度值-43.409×磷脂酰胆碱o-36:0浓度值+638.529

prob(结核性胸膜炎)＝1/(1+e^-x)

从所述受试者采集胸水样品，提取外泌体，加入内标(内标浓度见表2)，利用质谱法定量胸水外泌体样品中的二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸的浓度(ug/ml)，prob(结核性胸膜炎)为结核性胸膜炎的概率，cutoff＝0.5，即当prob(结核性胸膜炎)值小于0.5时，诊断为结核性胸膜炎。

表2.提取剂中内标及其浓度

所建模型对恶性胸膜炎和结核性胸膜炎具有良好的判别能力(见图2、3)，组合标志物的auc＝1.00、灵敏度为100％、特异性为100％(见表3)。此外，组合标志物在腺甙脱氨酶(ada)假阴性(<40umol/l)的结核性胸膜炎患者中的诊断准确率为60％(见图3)；优异的roc曲线结果中良好的正确诊断率以及和传统结核性胸膜炎标志物良好的互补性表明八种组合标志物具有为结核性胸膜炎诊断的潜力。

表3.各标志物及其组合在结核性胸膜炎组中的灵敏度和特异性

本发明具有的效果是：胸水外泌体中代谢物二甲基甘氨酸、胆碱、酰基肉碱10：2、磷脂酰胆碱35:6、磷脂酰胆碱o-36:0、磷脂酰乙醇胺33:2、鞘磷脂28:1和油酸可以联合用于结核性胸膜炎病人的识别。通过本发明涉及的组合标志物，能够对结核性胸膜炎的诊断具有高灵敏、高特异性特征。同时，该组合标志物可以与传统的标志物腺甙脱氨酶互补，联合使用能够用于结核性胸膜炎的辅助诊断。

实施例1

1.胸水样品收集采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

结核性胸膜炎纳入标准：具有结核性胸膜炎的临床表现：低热，盗汗，乏力，胸闷，有渗出性胸腔积液等；同时，胸水和/或痰液结核分枝杆菌培养阳性，和/或者胸膜组织病理学检查呈结核阳性；并且后续抗结核治疗有效者，诊断为结核性胸膜炎患者。

恶性胸膜炎组纳入标准：有渗出性胸腔积液，胸水脱落细胞发现肿瘤细胞；和/或者胸膜组织病理学检查明确为肿瘤胸膜转移。

相同条件下采用胸水样本：10例恶性胸膜炎和10结核性胸膜炎患者的胸水样本；入院后未进行任何治疗前留取患者胸水50ml，半小时之内分离胸水，置于-80℃冰箱保存，备检。

2.分析方法

2.1胸水样本预处理

胸水样在4℃下解冻，胸水样品依次通过10分钟500×g和20分钟2000×g离心，分别去除胸水中细胞、细胞碎片。移取30ml上清液，经过60分钟20000×g离心去除胸水中的微颗粒等，然后移取上清液，经过90分钟110000×g离心获得外泌体沉淀，用1mlpbs重悬外泌体沉淀样品，再经过90分钟110000×g离心获得外泌体沉淀样品，最后150μlpbs重悬外泌体沉淀样品，取其100μl，加入400μl含有多个内标的甲醇提取液沉淀蛋白：涡旋60s，静置30mins后，4℃条件下12000×g转速离心15mins，取上清冷冻干燥；加入50ul20％(v/v)甲醇水溶液，4℃条件下12000×g转速离心15mins，取上清进行lc-ms/ms分析，通过提取离子流图计算内标峰、八种代谢物的峰面积，以确定八种代谢物的浓度。提取剂中内标及其浓度见附表1。

2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：色谱仪为nexeralc-30ad超高效液相色谱(shimadzu,kyoto,japan)；色谱柱为watersacquityuplc@behc8(1.7um，2.1mmx100mm)(waters,ireland)；流动相a为流动相：a相为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，b相为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-1min为2％b相，1min-20min线性变化到80％b相，20min-25min线性变化到100％b，相保持4min，0.1min内线性降至2％b相并保持1mins；柱温为50℃；流动相流速为0.35ml/min；进样量为10μl。正负离子模式液相检测方法一致。

(2)质谱条件：质谱仪为四级杆-离子阱质谱(q-trap5500ms)(absciex,framingham,ma,usa)；正离子模式检测：气帘气,gas1,gas2分别设为50arbitraryunits，35arbitraryunits，35arbitraryunits；离子源温度为500℃，喷雾电压为5.0kv。负离子模式检测：气帘气,gas1,gas2分别设为50arbitraryunits，35arbitraryunits，35arbitraryunits；离子源温度为450℃，喷雾电压为-4.5kv。

2.3胸水测试结果及辅助诊断方法

对于恶性胸膜炎组，胆碱、二甲基甘氨酸、油酸、磷脂酰胆碱35:6、和磷脂酰胆碱o-36:0在结核性胸膜炎组中显著性升高，而酰基肉碱10：2、磷脂酰乙醇胺33:2、和鞘磷脂28:1则在结核性胸膜炎组中显著性降低(见图1)。同时，将各标志物的含量带入回归方程式中，计算出概率，采用的cutoff值为0.5，即组合标志物的概率小于0.5则认为是结核性胸膜炎，组合标志物的auc＝1.00，灵敏度和特异性也比较高，分别为100.0％和100.0％(见表3)。而常用的结核性胸膜炎临床标志物腺甙脱氨酶在结核性胸膜炎组也有低于诊断cutoff值(40u/l)的假阴性样本(10例结核性胸膜炎中有4例ada值小于40u/l)。进一步分析此结果，结核性胸膜炎中，10例结核性胸膜炎患者中有4例呈阴性反应(ada<40u/l),而采用组合标志物法对这4例病人进行诊断时，发现4例均呈阳性反应。这说明组合标志物与ada具有较好的互补性(见图3)，两者进行联合诊断更有助于提高检测结核性胸膜炎的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。