一种利用HPLC检测工业大麻中大麻萜酚（CBG)的方法与流程

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种利用hplc检测工业大麻中大麻萜酚（cbg)的方法。

背景技术：

时下，工业大麻正成为全球热点，被广泛用于纺织、造纸、功能保健品、化妆品、医药、生物能源、建材、新材料等行业。

工业大麻是指四氢大麻酚（thc）含量低于0.3%的大麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素类化合物，主要的大麻酚类化合物有四氢大麻酚（thc）、大麻酚（cbn）、大麻二酚（cbd）、大麻萜酚（cbg）、大麻环萜酚（cbc）等。其中大麻萜酚（以下简称cbg）具有较高的医疗价值，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗抑郁、止吐、止痛的效果，还可用于治疗银屑病。有研究认为cbg是大麻植物物质转化中cbd和cbc的直接前体。

cbg是非精神活性成分，存在于大麻生长周期的早期，所以很难找到大量的cbg，这就意味着通过栽培大麻才能获得其医疗价值，故准确测定花叶中的cbg含量十分重要。但目前尚未有权威的cbg检测标准，因此开发一种能够准确测定工业大麻花叶中cbg含量的检测方法十分必要。

技术实现要素：

本发明使用甲醇超声提取工业大麻花叶中的大麻萜酚（cbg），用高效液相色谱仪(hplc)检测，外标法进行定量，能够准确、快速的检测工业大麻花叶中的大麻萜酚（cbg）含量。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种工业大麻花叶中大麻萜酚（cbg）含量的测定方法，包括如下步骤：

①样品的准备：将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥，粉碎机粉碎，混匀待测。

②样品的前处理：准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，离心收集上清液，残渣重复超声提取一次，离心，合并上清液，浓缩定容得到样品处理待测液。

③标准工作溶液的配置：将购买的大麻萜酚（cbg）标准溶液用甲醇稀释至浓度范围为1μg/ml～100μg/ml的混合标准工作溶液，其浓度范围覆盖试样中待测组份的含量。

④用高效液相色谱法（hplc法）测定：利用hplc对标准工作溶液和样品处理液进行检测，测定方法是以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对制备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品中待测组分的浓度，进而计算得其含量；若样品处理液浓度超过标准工作溶液浓度范围，则稀释后再检测。

高效液相色谱仪（hplc）条件如下：流动相为乙腈（色谱纯）和水（去离子水），乙腈与水的比例为65%：35%，等度洗脱，流速为1ml/min；进样量为10ul；柱温为30℃；检测器检测波长为220nm。

进一步的，步骤①中所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物。

进一步的，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇所用体积量与花叶样品质量比为10:1；所述超声时间为20min，超声功率为250w，工作频率为40khz；所述离心的转速为10000转/分钟，时间为5分钟。

进一步的，步骤③中所述配制浓度范围为1μg/ml～100μg/ml的cbg系列标准工作溶液步骤为：

①将购自美国sigma公司的cbg标准物质（1mg/ml，共1ml）转移至10ml容量瓶中，用色谱级甲醇洗涤原瓶及滴管数次，并全部转移至容量瓶中（注意转移过程中不能洒出），定容，得cbg溶液浓度为100μg/ml。

②用移液管分别吸取100μg/ml的cbg标准溶液2ml、1ml、1ml分别至5ml、5ml、10ml的容量瓶中用甲醇定容得到40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml的cbg标准溶液。

③用移液管吸取40μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到4μg/ml的cbg标准溶液。

④用移液管吸取20μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到2μg/ml的cbg标准溶液。

⑤用移液管吸取10μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到1μg/ml的cbg标准溶液。

进一步地，所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260；流动相的乙腈为色谱纯，水为去离子水；色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18；所述检测器为二极管阵列检测器(简称dad检测器)。

本发明的优点：

①本发明建立了一种利用hplc检测工业大麻中大麻萜酚（cbg)的方法，能够对工业大麻中cbg化合物进行定性和定量分析，为大麻萜酚成分和含量的准确判定和快速检测提供科学依据。

②本发明用甲醇进行超声提取大麻花叶中的cbg，实验操作简单，处理时间短，hplc在15分钟内即可完成检测，检测结果准确稳定。

附图说明

图1大麻萜酚（cbg）标准对照品色谱图。

图2大麻萜酚（cbg）标准曲线。

图3实施例1大麻花叶样品色谱图。

具体实施方式

以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。

实施例1

（1）样品的准备：将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。

（2）样品的前处理：准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10ml色谱纯甲醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10ml甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10ml容量瓶中，甲醇定容，过0.22μm有机滤膜得到待测液。

（3）标准工作溶液的配置：配制1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的cbg系列对照品溶液，步骤如下：

①将购自美国sigma公司的cbg标准物质（1mg/ml，共1ml）转移至10ml容量瓶中，用色谱级甲醇洗涤原瓶及滴管数次，并全部转移至容量瓶中（注意转移过程中不能洒出），定容，得cbg溶液浓度为100μg/ml。

②用移液管分别吸取100μg/ml的cbg标准溶液2ml、1ml、1ml分别至5ml、5ml、10ml的容量瓶中用甲醇定容得到40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml的cbg标准溶液。

③用移液管吸取40μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到4μg/ml的cbg标准溶液。

④用移液管吸取20μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到2μg/ml的cbg标准溶液。

⑤用移液管吸取10μg/ml的cbg标准溶液1ml至10ml的容量瓶中用甲醇定容得到1μg/ml的cbg标准溶液。

（4）用高效液相色谱法（hplc法）测定：利用hplc对标准工作溶液和样品处理液进行检测，测定方法是以标准工作溶液目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；对制备好的样品进行测定，测得检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品中待测组分的浓度，进而计算得其含量；若样品处理液浓度超过标准工作溶液浓度范围，则稀释后再检测。

高效液相色谱仪（hplc）品牌型号为安捷伦1260条件如下：流动相为乙腈和水，乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为65%：35%，等度洗脱，流速为1ml/min；进样量为10ul；色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18，柱温为30℃；检测器为波长二极管阵列检测器(简称dad检测器)，检测波长为220nm。

cbg出峰时间：13.2min，标准曲线：y=44.9911x-4.9173，r=0.99951，r²=0.99902。

实验例1重复性实验

按照实施例1的方法制备处理样品。取同一个样品做6份平行样，平行操作，重复做三天，考察重复性。结果见表1，目标物cbg的峰面积日内rsd与日间rsd均小于3％，表明本方法重复性良好。

表1重复性实验结果（峰面积）

实验例2加标回收率实验

按照实施例1的方法制备处理样品。同一个样品称取4份，两份作为基底样品，另两份中加入cbg标准品作为加标样品（cbg添加量为20μg/g，称样后加入标准品，平衡12h后进行处理），4个样品平行操作，样品检测结果及加标回收率结果见表2。两个加标样品平均加标回收率为89.8%，说明发明方法准确度高，能够满足检测要求。

表2加标回收率实验结果