一种高效液相-质谱法检测亚精胺含量的方法与流程

本发明涉及一种多胺类物质亚精胺的分离检测方法，具体为利用液相质谱(hplc-ms/ms)检测动物组织中亚精胺的含量。

背景技术：

生物胺是生物体内一类分子质量较低，具有生物活性的含氮有机化合物的总称，广泛存在与水产品，肉类，乳制品和蔬菜中。亚精胺具有抗氧化，抗炎，改善线粒体代谢的功能，亚精胺也存在于人体中，与人类健康息息相关。适量的亚精胺有利于人体健康，但当其在动物和人体内积聚达到高水平或其摄入过量时会变得具有毒性，可能引起头痛，头晕心悸等症状，因此有必要对人体中的亚精胺含量进行有效检测和控制。

由于亚精胺结构中没有生色基团，既没有紫外吸收，也没有荧光及电化学活性，使其分离和测定都存在一定的困难。目前国内外应用有多种方法研究，目前常用的检测方法有：高效液相色谱(hplc)、同位素标记等。

由于高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高等特点，许多应用中均使用高效液相色谱测定食品中的亚精胺含量，但是，高效液相色谱需要将目标物进行柱前柱后衍生之后才能进行检测，因此存在操作复杂，反应条件苛刻，质量控制相对较难等不足，更加不适用于作为动物组织中亚精胺含量的检测。液相质谱(hplc-ms/ms)作为一种新型分离检测技术，与传统的液相色谱相比，具有灵敏度高，样品消耗少，分离速度快等优点。

因此，本发明旨在建立一种简单、快速的动物组织亚精胺检测方法。

技术实现要素：

本发明基于上述不足之处，优化动物组织处理方法，优化色谱质谱条件，建立一种简单且快速的亚精胺检测方法，适用于动物组织中亚精胺的监测。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种高效液相-质谱法检测亚精胺含量的方法，所述方法为：

(1)样品制备：将待测样品加入提取溶液中，研磨匀浆直至样品完全呈现匀浆状态，于20℃、20khz超声提取15min，离心(优选12000转离心15min)，吸取上清，即为上样样品；所述提取溶液为体积比1:1的乙腈和水；所述提取溶液体积用量以待测样品重量计为5～10μl/mg；所述研磨是在磁珠作用下超声(优选65hz，90s)进行，所述磁珠直径为2～3mm，所述磁珠加入量以提取溶液体积计为2～3颗/600μl；

(2)将步骤(1)上样样品进行高效液相-质谱检测，获得亚腈胺峰面积，然后根据亚腈胺标准曲线，获得待测样品中亚腈胺含量；

所述液相条件为：采用agilent1290infinityseries和triplequadrupole6420fromagilenttechnology(santaclara,ca,usa)；色谱柱：亲水作用色谱(hilic)柱(100mm×2.1mm，5μm，mstechnologies)；流动相：乙腈-0.2％甲酸水(体积比为1：1，等度洗脱)；流速：0.5ml/min；进样量：3μl；柱温：30℃；扫描方式：电喷雾正离子(esi+)扫描；检测方式：多反应检测(mrm)；fragmentor电压：65～75v，ce电压：10～20ev。

进一步，所述待测样品包括：粪便、肝脏、肾脏、结肠、空肠、回肠、肌肉、脾脏、棕色脂肪或附睾脂肪。

进一步，所述亚腈胺标准曲线按如下方法制备：将亚精胺标准品，用乙腈稀释成浓度分别为50ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，800ng/ml的稀释液，过0.22μm尼龙膜，然后进行高效液相-质谱检测(检测条件同待测样品)，以亚腈胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，获得亚腈胺标准曲线。

本发明采用50％乙腈水溶液对样品进行匀浆，超声，离心后收集上清用于质谱分析；针对质谱条件优化：主要包括母离子选择，子离子选择和去簇电压及其碰撞能量优化。母离子选择：以亚精胺标准品溶液为实验对象，在正离子扫描模式下进行母离子全扫描，在最高响应强度下，选择m/z146.2离子为母离子；子离子选择：在母离子优化条件下，进行全扫描，选择最高响应强度，确定m/z72.3离子为子离子；在确定定性离子和定量离子后，对亚精胺的去簇电压及其碰撞能量进行优化，在最高相应强度下，确认在多反应检测(mrm)下，最终选用最优条件为去簇电压：70v，碰撞电压：15ev。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明验证动物组织中的亚精胺浓度50～800ng/ml条件下具有良好的线性关系(r＞0.99)，准确度高(高中低浓度90.2％～115％)，方法选择性、残留、稀释可靠性及基质效应均符合要求。

附图说明

图1：亚精胺标准品在多反应检测条件下的峰响应质谱图。

图2：以亚精胺标准溶液的浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行二次曲线回归图。

图3：利用hplc-ms/ms测得小鼠粪便样品中的亚精胺的峰响应质谱图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1亚精胺标准曲线

1、亚精胺标准品溶液的制备

称取0.1mg亚精胺标准品，用乙腈梯度稀释成浓度分别为50ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，800ng/ml，置于离心管中。准备好液相瓶，在液相瓶壁上做好标记与离心管标记一一对应，用1ml注射器将离心管中的样品吸取200-300μl过0.22μm尼龙膜，轻甩，确认液相瓶中底物无气泡沉淀，盖上盖子，旋紧。

2、色谱条件

在样品正式上柱之前，提前打开机器，确定电压值稳定后开始操作。液相质谱分析条件：采用agilent1290infinityseries和triplequadrupole6420fromagilenttechnology(santaclara,ca,usa)；色谱柱：亲水作用色谱(hilic)柱(100mm×2.1mm，5μm，mstechnologies)；流动相：乙腈-0.2％甲酸水(体积比为50：50，等度洗脱)；流速：0.5ml/min；进样量：3μl；柱温：30℃。

3、质谱条件

扫描方式：电喷雾正离子(esi+)扫描；检测方式：多反应检测(mrm)；fragmentor电压：70v，ce电压：15ev。

亚腈胺标准品50ng/ml在多反应检测条件下的峰响应质谱图如图1所示，由图1所示，亚精胺标准品0.548min时出峰，且定量和定性离子分别是146.2和72.3。

按优化好的实验条件进行分析，不同浓度亚腈胺标准品溶液峰面积如表1所示。以亚精胺标准品溶液的浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行二次曲线回归，得到标准曲线(图2)：y＝-0.180777*x²+508.481505*x+315.700261；r²＝0.998。

表1不同浓度亚精胺标准品溶液对应的峰面积

实施例2

1、样品的制备

取60mg小鼠粪便于离心管中，加入600μl提取溶液，提取溶液为体积比1:1的乙腈与水混合物。加入2颗个磁珠(直径2～3mm)，用组织研磨仪研磨，65hz，90s，直至样品完全呈现匀浆状态，于20℃超声(20khz)提取15min，12000转离心15min，吸取上清到新的离心管中。

2、质谱分析

用1ml注射器吸取300μl步骤1离心管中的上清液，过0.22μm尼龙膜，轻甩，确认液相瓶中底物无气泡沉淀，盖上盖子，旋紧，置于4℃保存，进行质谱分析。

液相质谱分析条件：采用agilent1290infinityseries和triplequadrupole6420fromagilenttechnology(santaclara,ca,usa)；色谱柱：亲水作用色谱(hilic)柱(100mm×2.1mm，5μm，mstechnologies)；流动相：乙腈-0.2％甲酸水(体积比为50：50，等度洗脱)；流速：0.5ml/min；进样量：3μl；柱温：30℃。

扫描方式：电喷雾正离子(esi+)扫描；检测方式：多反应检测(mrm)；fragmentor电压：70v，ce电压：15ev，设定定量和定性离子分别是146.2和72.3。

观察结果，由图3可得，粪便中测得亚精胺在0.548min出峰，根据亚精胺标准曲线可算出粪便中含量亚精胺含量为243.27ng/g。

实施例3

将实施例2中样品替换为表2所示，解剖c57bl6j雄性小鼠(22～25g)，分别取出肝脏、肾脏、结肠、空肠、回肠、肌肉、脾脏以及棕色脂肪和附睾脂肪，放于-80℃保存，检测时，取出样品60mg置于无菌离心管内，采用实施例2方法检测，结果见表2。由表2可知，小鼠不同组织中的亚精胺含量在100ng/g～500ng/g范围之中。

表2小鼠中不同组织样品中亚精胺的含量

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术内容做任何形式上的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明的保护范围内。