本发明涉及基因工程重组手足口病疫苗制备技术，尤其涉及一种重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法及其在制备重组手足口病疫苗中的应用。
背景技术：
：甲醇作为能源和诱导剂在重组汉逊酵母等表达的手足口病疫苗制备过程中不可或缺，但其微量残留对疫苗制品的安全性带来极大隐患。由于酵母在发酵过程中加入甲醇作为能源和诱导剂，而重组手足口病疫苗接种对象主要为未满周岁幼儿，其对甲醇残留的耐受度更低，即使微量残留亦会引起皮肤红晕等不适。因此对于重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量的检测显得尤为重要。现有技术中，尚缺乏准确测定重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量的方案。技术实现要素：本发明所解决的技术问题是，提供一种重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法，该方法可对重组手足口病疫苗原液的甲醇残留量进行准确测定，为重组手足口病疫苗安全性提供依据，为工艺的稳定性提供真实、可靠、有效的数据。本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法在重组手足口病疫苗制备过程中的应用，该应用可对重组手足口病疫苗原液的甲醇残留量进行准确测定，为重组手足口病疫苗安全性提供依据，为工艺的稳定性提供真实、可靠、有效的数据。为了解决上述技术问题，本发明公开了一种重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法，包括以下步骤：制备样品溶液；样品溶液通过顶空进样器进入气相色谱仪，测定样品溶液中的甲醇含量。在一些可能的实施方式中，所述样品溶液包括：溶剂对照样品、系统适用性样品、标准曲线溶液、供试品。在一些可能的实施方式中，所述甲醇含量通过以下步骤测定：检测样本信号；按照外标法以甲醇标准曲线溶液浓度为横坐标，对应的甲醇峰面积为纵坐标拟合直线回归方程，并将样品的甲醇峰面积均值代入方程，计算出样品溶液甲醇含量测定值。在一些可能的实施方式中，所述溶剂对照样品为含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液。在一些可能的实施方式中，所述系统适应性样品通过以下步骤制备：取甲醇对照品制备甲醇对照品贮备液，加入含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液定容，得到甲醇对照品溶液；取若干份甲醇对照品溶液，得到若干份系统适应性样品。在一些可能的实施方式中，所述标准曲线溶液通过以下步骤制备：取若干份不同体积的甲醇对照品贮备液，在每份甲醇对照品贮备液中加入含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液至相同体积，配制成若干份不同浓度的甲醇标准曲线溶液。在一些可能的实施方式中，所述甲醇标准曲线溶液的溶度分别为2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/ml。在一些可能的实施方式中，采用火焰离子化检测器检测样本信号。在一些可能的实施方式中，所述手足口病疫苗为重组肠道病毒71型疫苗。相应地，本发明还公开了一种上述重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法在制备手足口病疫苗中的应用。本发明的有益效果是：本发明的实施例通过制备样品溶液并使得样品溶液通过顶空进样器进入气相色谱仪，测定样品溶液中的甲醇含量。从而准确地测定了重组手足口病疫苗原液中甲醇含量。操作简便，对微量甲醇残留检测准确性高，为重组手足口病疫苗的安全性提供可靠数据，同时也为其他重组蛋白类疫苗甲醇残留量检测提供参考。具体实施方式下面详细描述本发明提供的重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法的实施例；本实施例主要包括以下步骤：制备样品溶液；样品溶液通过顶空进样器进入气相色谱仪，测定样品溶液中的甲醇含量。在一些可能的实施方式中，所述样品溶液包括：溶剂对照样品、系统适用性样品、标准曲线溶液、供试品。在一些可能的实施方式中，所述甲醇含量通过以下步骤测定：检测样本信号；按照外标法以甲醇标准曲线溶液浓度为横坐标，对应的甲醇峰面积为纵坐标拟合直线回归方程，并将样品的甲醇峰面积均值代入方程，计算出样品溶液甲醇含量测定值。在一些可能的实施方式中，所述溶剂对照样品为含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液。在一些可能的实施方式中，所述系统适应性样品通过以下步骤制备：取甲醇对照品制备甲醇对照品贮备液，加入含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液定容，得到甲醇对照品溶液；取若干份甲醇对照品溶液，得到若干份系统适应性样品。在一些可能的实施方式中，所述标准曲线溶液通过以下步骤制备：取若干份不同体积的甲醇对照品贮备液，在每份甲醇对照品贮备液中加入含聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液至相同体积，配制成若干份不同浓度的甲醇标准曲线溶液。在一些可能的实施方式中，所述甲醇标准曲线溶液的溶度分别为2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/ml。在一些可能的实施方式中，采用火焰离子化检测器检测样本信号。在一些可能的实施方式中，所述手足口病疫苗为重组肠道病毒71型疫苗。本发明实施例公开的一种重组手足口病型疫苗原液中甲醇残留量测定方法在制备手足口病疫苗中的应用，包括有如前述实施例所描述的甲醇残留量测定方法，其余与现有技术相同，不再一一赘述。为了更进一步阐释本实施例为达成预定发明目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量测定方法的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。实施例1：仪器设备：(1)气相色谱仪：安捷伦7890b型(2)顶空进样器：安捷伦7697a型(3)分析天平：sartoriusac-210s，分度值0.1mg(4)氢气发生器厂家和型号：北京东方精华苑科技sgh-300高纯氢发生器(5)分析色谱柱：agilenttechno1ogiesdb-624毛细管色谱柱，长30m，内径0.32mm，膜厚1.80μm，温度范围-20℃～260℃。(6)顶空瓶：安捷伦，20ml(7)氮气：高纯氮气，纯度≥99.999％。试剂：甲醇对照品：国药集团化学试剂有限公司，货号scrc40030561，色谱纯(gc)检测步骤：(1)1000μg/ml甲醇对照品贮备液的制备，精密量取甲醇对照品100mg到装有少量纯化水的100ml容量瓶中，并用纯化水定容至刻度线，混合均匀，得到1000μg/ml甲醇对照品贮备液。(2)含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液的制备，精密称取磷酸氢二钠0.696g，一水磷酸二氢钠0.734g，氯化钠8.766g，聚山梨酯80100mg，加入纯化水定容至1000ml。(3)溶剂对照制备，量取1ml含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液置于20ml顶空瓶中，制备1份样品。(4)系统适用性样品制备，取1000μg/ml甲醇对照品贮备液0.1ml，加含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液定容至10ml，即为10.0μg/ml甲醇对照品溶液。精密量取10.0μg/ml甲醇对照品溶液1ml置于20ml顶空瓶中，制备5份样品。(5)甲醇标准曲线溶液制备，分别取1000μg/ml甲醇对照品贮备液20、50、100、250、500μl至10ml容量瓶中，补加含100μg/ml聚山梨酯80的0.01mol/l磷酸盐缓冲液至刻度线，配制成2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/ml的甲醇标准曲线溶液。取各标准曲线溶液1ml置于20ml顶空瓶中，制备2份样品。(6)样品溶液制备，用纯化水将1000μg/ml甲醇对照品贮备液稀释成100μg/ml甲醇对照溶液，按照下表配制供试品，量取样品溶液1ml置于20ml顶空瓶中，制备2份样品。表一、样品100μg/ml甲醇对照品溶液(ml)原液(ml)理论加标量(μg/ml)样品10100样品20.29.82样品30.19.91(7)安装色谱柱，依次打开载气(氮气)，顶空进样器电源和气相色谱仪主机。待顶空进样器和气相色谱仪主机自检通过后，设置毛细管色谱柱的氮气流速为1.0ml/min，打开高纯氢发生器电源，待压力上升至0.4mpa。(8)在gc主机面板上设置柱温箱升温程序，起始柱温为40℃，以10℃/min的速率升至230℃(低于最高使用温度30℃处)保持至少30min，再以10℃/min的速率降至起始柱温，设置进样口温度200℃，检测器温度250℃，点击“start”，以设置的程序老化色谱柱。(9)打开空气源，设置氧气流速为400ml/min，氢气流速为40ml/min，待流速稳定后，点击控制面板上的“on/yes”点火。(10)设置采集所以样品的峰面积、保留时间和理论塔板数，将建立的采集方法发送至仪器，气相色谱仪即开始在该方法下平衡仪器(色谱柱和检测器)，直至20分钟内基线漂移不超过1pa，且仪器各模块均为绿色就绪状态，即可运行。(11)将制备好的样品放入顶空进样器，先后顺序为：溶剂对照、系统适用性样品、标准曲线溶液、供试品。(12)色谱条件载气：n2载气色谱柱流量：1.0ml/min分流比：5∶1升温程序：起始柱温为40℃，保持6min，以每分钟10℃的速率升温至100℃，以每分钟30℃的速率升温至220℃，保持5min。检测器温度：250℃进样口温度：200℃(13)采用项空进样，顶空条件为恒温炉温度为80℃、样品流路温度为150℃、传输线温度为170℃、平衡时间30min、进样量1ml，保存样品序列，点击“运行”即开始运行样品，记录主峰的保留时间、峰面积。(14)数据处理用系统适用性样品色谱图建立标准曲线和样品数据处理方法，应按如下方式设定其积分参数：点击“处理方法”，在“chemstation积分事件”选项中选择“标准”-“通用”，设置参数，如下表所示。表二、事件值斜率灵敏度1.00峰宽0.02最小峰面积1.00最小峰高0.01选中系统适用性样品的目标峰，在“化合物”的子菜单“识别”中将其命名为“甲醇”，在另一个子菜单“校正”中依次设置“原点”为忽略，“级别1”为2.0，“级别2”为5.0，“级别3”为10.0，“级别4”为25.0，“级别5”为50.0。“系统适用性”的子菜单“属性”的“色谱柱性能”和“信噪比”选项均为所有峰。用建立的样品处理方法对所有样品的图谱进行处理。(15)以甲醇标准曲线溶液浓度为横坐标，对应的甲醇峰面积为纵坐标拟合直线回归方程，再将样品的甲醇峰面积均值代入方程，计算出样品溶液甲醇含量测定值。表三、检测结果：样品名称加标量(μg/ml)甲醇含量(μg/ml)回收率(％)样品10未检出n/a样品21.01.06106样品32.02.10105甲醇加标回收率符合《中华人民共和国药典》80.0～120.0％要求，证明该方法能准确测定重组手足口病疫苗原液中的甲醇含量。通过上述实例所测定的甲醇残留量数据可知，本发明实施例可实现重组手足口病疫苗原液中甲醇残留量的准确测定。以上内容是结合具体实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页12