一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器的制作方法

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于检测人血清中pb²⁺浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法。

背景技术：

铅为重金属污染物之一，铅离子的超标严重影响了人类生活环境及健康。美国环境监测部门规定饮用水中铅离子标准为15ppb(15ngml^-1；72.4nm)(

li,c.l.；huang,c.-c.；chen,w.-h.；chiang,c.-k.；chang,h.-t.,peroxidasemimickingdna–goldnanoparticlesforfluorescencedetectionoftheleadionsinblood.analyst137(22),5222.)。对于检测铅离子，已经开发出的检测方法有电化学法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法，然而这些方法因耗能大、操作繁杂、不能快速检测，有一定局限性。荧光光谱法具有开发简单，灵敏，低耗时，低耗能等优点，因此被广泛应用于铅离子的检测。

研究人员利用功能核酸适体具有简易，灵敏，高选择性等优点，开发出了基于功能性核酸适体的多种多样检测铅离子的荧光传感器。但目前针对人血清样品中pb²⁺含量的检测灵敏度不够理想，需要寻找更加理想的核酸适体荧光传感器。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种灵敏度高、抗干扰能力强的核酸适体荧光传感器，将其用于人血清中pb²⁺浓度的检测。

为实现本发明目的，技术方案如下：

由两条部分互补dna链t30695、z作为适体(dna碱基序列见表1)，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(amt)荧光染料作为传感指示剂。amt自身在缓冲溶液中具有强荧光，而其与g-四连体结合后荧光极大猝灭，两条适配体在充分孵育后能够形成更加稳定的平行g-四链体，从而紧密的结合荧光染料amt并使其荧光猝灭。向构建好的传感体系中加入目标检测物铅离子时，铅离子结合力(logk≈7)强于amt与g-四链体结合力(logk≈5)。使得体系中加入pb²⁺后，pb²⁺与g-四链体特异性结合置换出g-四链体-amt中的amt，形成反平行g-四链体-pb²⁺，同时amt被释放，体系荧光增强，达到检测目的。本发明所构建传感体系反应机理见图1。

荧光指示剂amt作为指示剂结构式如下：

圆二色(cd)光谱广泛用于表征dna的二级结构。由于g-四链体具有特征cd信号，因此cd光谱用于验证假设的传感机理，图3为该体系下圆二色谱表征图。图3a中(1)为t30695圆二色谱图，该cd谱在240nm有一负峰，265nm处有一正峰，该特征峰为平行g-四链体特征峰，因此t30695特征信号为平行g-四链体；(2)为z的圆二色谱图，在260nm处有一负峰，295nm处有一正峰，该特征信号为反平行g-四链体；由t30695和z以3:1比例混合充分孵育后圆二色谱图在240nm有一负峰，265nm有一正峰，为平行g-四链体。

图3b可以看出，当amt加入到0.25umt30695/z混合液(duplex)中，圆二色谱信号基本无变化，说明amt与双链结合荧光猝灭不影响dna结构，amt嵌入双链所形成的平行g-4中使得荧光猝灭。

图3c中，加入pb²⁺离子后240nm负峰逐渐减弱，平行g-四信号减弱，并且同时随着pb²⁺浓度增大在295nm有一负峰强度增大，315nm处有一正峰强度增大，该特征信号为铅离子稳定的反平行g-四链体结构特征峰，cd信号由平行g-四转变为pb²⁺稳定的反平行g-四，这主要是由于g-四链体与pb²⁺结合能力(logk≈7)大大强于g-四链体与amt结合能力(logk≈5)，使得体系中加入pb²⁺后置换出g-四链体-amt中的amt，形成g-四链体-pb²⁺。同时amt被释放，体系荧光大大增强，验证了设想。

本发明基于平行g-四链体诱导amt荧光猝灭，铅离子与补骨脂素竞争性结合适体，导致由amt-适体平行g-四链体转变为pb²⁺-适体反平行g-四链体从而释放出补骨脂素，构建了一种荧光增强型传感器。

本发明创新点及优点在于：选择经济、高水溶性和低毒性的荧光指示剂amt作为指示剂，利用g-四链体的强淬灭能力，开发了一种新型无标记，高选择性，高灵敏度的荧光增强型适体传感器。所开发的适体传感器在10nm～300nm的pb²⁺浓度范围内检测具有高选择性和良好的准确度，通过3σ/k公式计算出检测限(lod)为1.98nm。与其它传感器相比，对pb²⁺具有较高选择性。利用适体传感器成功分析了稀释人血清样品中的pb²⁺。所开发的适体传感器在实际临床复杂样品中检测pb²⁺具有实际应用价值。利用g-四链体的猝灭能力，通过合理的设计可以开发各种新型传感器，拓宽了其应用前景。

本发明涉及的dna序列见序列表。

附图说明

图1为本发明基于无标记适体检测pb²⁺的原理图；

图2为在10mmmes-tris(ph＝5)的缓冲溶液、4μmamt中不同适配体时，对pb²⁺的荧光传感响应图，适配体浓度均为4μm。

图3为10mmmes-tris(ph＝5)缓冲溶液中，加入pb²⁺前后dna的圆二色(cd)光谱图变化，其中，图a为(1)0.2μmt30695，(2)0.2μmz，(3)0.2μmt30695+z；图b为(1)0.2μmt30695+z；(2)0.2μmt30695/z+1μmamt；(3)0.2μmt30695/z+2μmamt；(4)0.2μmt30695/z+4μmamt；图c为中(1)为0.2μmt30695+z，(2)为0.2μmt30695/z+4μmamt，其他为体系中加入不同浓度的pb²⁺，沿左箭头依次为：(3)t30695/z/amt+1μmpb²⁺；(4)t30695/z/amt+3μmpb²⁺；(5)t30695/z/amt+5μmpb²⁺；(6)t30695/z/amt+10μmpb²⁺；(7)t30695/z/amt+15μmpb²⁺；(8)t30695/z/amt+20μmpb²⁺。

图4为ph值及缓冲溶液浓度对传感体系的影响，图a为本发明体系中(20μmpb²⁺)，不同ph值条件下测定的荧光增强f/f0变化柱状图；图b为本发明体系中(20μmpb²⁺，ph＝5)，不同浓度的mes-tris的缓冲溶液中测定的荧光增强f/f0变化曲线。

图5为本发明传感体系优化条件的选择图，其中a为k⁺浓度对体系传感性能的影响；b为amt浓度对体系传感性能的影响；c为t30695与z两条适配体的比例对体系传感性能的影响；d为t30695与z两条适配体浓度对体系传感性能的影响。

图6为在10mmmes-tris(ph＝5)的缓冲溶液中，加入不同浓度pb²⁺的动力学响应图。

图7为本发明体传感体系对pb²⁺的荧光光谱响应图，内插图：以pb²⁺浓度为函数对荧光响应f/f0的关系图。

图8为本发明体传感体系中f/f0与pb²⁺浓度的线性关系图。

图9为本发明体传感体系中加入pb²⁺类似物的荧光响应图，检测物浓度均为5μm。其中，a为干扰物单一加入体系中，b为干扰物和pb²⁺共同加入体系中。

图10中a为本发明传感体系在1％人血清中对pb²⁺的荧光光谱响应图，内插图：以pb²⁺浓度为函数对荧光响应(f/f0)-1＝0.4143c+0.0318的关系图。b为荧光响应(f/f0)与pb²⁺浓度的线性关系图，线性范围：10nm-7μm。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

实施例1

1.1、实验药品及仪器。

4'-aminomethyltrioxsalenhydrochloride(amt)，购于sigma(中国，上海)公司；mes(c6h13o4ns·h2o)购于北京solarbio科技有限公司，tris(hydroxymethyl)-aminomethane，分析纯，购于serva(中国，上海)公司；kcl，mgcl2、kno3、nano3、mg(no3)2、al(no3)3、zn(no3)2、fe(no3)3、cu(no3)2、hg(no3)2、cr(no3)3、co(no3)2、agno3、nino3、mn(no3)2、cd(no3)2购于国药集团化学试剂有限公司，标准pb²⁺溶液购于国家标准物质商城，10mmmes溶液滴加tris调节ph。溶液均由超纯水配制(电阻率：18.2ω)。ph的测量采用雷磁(上海)phs-3c酸度计。t30695，z，ps2.m，pw17，agro100，eda2，tba为page纯化，均购于生工生物工程(上海)公司。dna序列如表1：

表1本发明用到的dna序列

1.2、传感体系构建

传感体系使用10mmph＝5.0mes-tris缓冲溶液，所有dna储备液由超纯水配制后在95℃水域保持加热10分钟后缓慢冷却至室温做退火处理，t30695与z混合孵育一周，冷冻保存做储备液。在条件优化后选择使用4μmamt，4μmt30695与z混合于dna(混合t30695与z体积比例为3：1)。将amt、混合dna溶解在mes-tris缓冲溶液中均匀混合，检测时取构建好的体系溶液500μl，再向其中加入不同浓度pb²⁺溶液，充分混匀后室温下进行检测。

1.3、荧光光谱分析

荧光光谱采用日立f-7000荧光光谱仪测量。对于加入pb²⁺响应的荧光检测，将不同浓度的pb²⁺加入含有4μmt30695+z(3:1),4μmamt的10mmmes-tris(ph＝5)缓冲溶液中，并将溶液在室温下充分搅拌。然后立即测定荧光发射光谱。激发和发射的狭缝均设定为5nm，扫描速度为中等(240nm/min)。传感体系的荧光发射波长为360nm至660nm，激发波长为340nm。

1.4、圆二色性(cd)光谱分析

cd光谱实验采集自bio-logicmos-450圆二色谱仪，测试时光源始终保持在稳定的高纯氮(99.99％)气流中。光谱采集的波长范围是220-320nm，选用1cm光路的石英比色皿池，仪器的扫描速率设为100nm/min，响应时间为2s。缓冲溶液的背景信号已经从cd数据中扣除。

1.5、人血清的处理及atp的测定

将人正常人血清(商丘市第一人民医院)与乙醇以1:1的体积比例混合震荡，混合均匀后放置于冰箱(-4℃)冷藏过夜，第二天取出后15000r/min离心10min，取上清液于超滤离心管(amiconultra-0.5ml,millipore,分子截留量3kpa)1300r/min4℃冷冻离心20min后取过滤液，并冷冻于冰箱中待用。将4μm孵育好的t30695+z(3:1)混合dna和4μmamt及不同浓度的pb²⁺加入含有稀释至1％人血清的mes-tris(ph＝5)缓冲液中，立即记录荧光发射光谱。

2、结果与讨论

2.1、反应体系条件优化

为达到传感体系最佳状态，进行了一系列实验探索最佳实验条件。首先在4-6.5的ph范围内探索ph对pb²⁺检测的影响。结果如图4a中所示，与ph4.0,4.5,5.5,6.0,和6.5相比，ph5.0时显示出20μmpb²⁺测定的最高荧光增强7.315倍(f/f0)。f和f0分别为在存在与不存在pb²⁺时最大荧光强度。因此，ph5.0用于以下实验中。

缓冲溶液的浓度对传感体系的影响如图4b，在tris-mes(ph＝5)缓冲溶液浓度为10mm时传感体系对pb²⁺离子响应最佳，我们将10mm浓度作为传感体系缓冲溶液浓度。

一价阳离子(k⁺，na⁺等)可影响g-四链体的空间结构和稳定性。因此，检测了体系中k⁺浓度对传感体系的影响。结果如图5a所示，在传感体系中加入不同浓度的k⁺，结果表明，f/f0随着k⁺浓度从0mm增加到50mm而降低。体系在不含有k⁺时传感效果最佳，这可能是由于加入k⁺后g-四链体过于稳定，pb²⁺和适配体的结合程度较低，导致不能改变g-四链体结构并释放amt。

紧接着，当amt浓度高于3μm时传感体系性能趋于平稳(图5b)，选择4μmamt用于传感体系。两条适配体的比例也影响适配体与铅离子的结合，从图5c中可以看出，当两条dna比例为3：1时，传感性能最佳。最后，研究了分裂适配体浓度对传感性能的影响，从图5d可以看出，f/f0随着分裂适体浓度的增加而增加，并且在t30695与z混合dna浓度为4μm时达到最大值。

2.2动力学检测缓冲溶液中的atp

传感体系的荧光强度与添加pb²⁺的反应时间之间的关系如图6所示。在构建好的传感体系中加入20mmpb²⁺，反应5分钟后荧光强度逐渐趋于稳定，因此我们选择5分钟作为系统测试的反应时间。

2.3、传感体系对pb²⁺的荧光响应

在最佳实验条件下加入不同浓度的目标物pb²⁺后，探究了检测的可行性。如图7所示，随着从0-10μmpb²⁺浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐增加。当pb²⁺浓度超过10μm时，荧光强度趋于平稳。如图7内插图所示，当pb²⁺浓度超过10μm时，f/f0对pb²⁺浓度(f和f0是存在和不存在pb²⁺时的荧光强度)显示出荧光约增强8倍。f/f0对pb²⁺浓度的线性图(图8)显示检测pb²⁺的线性范围为10nm至300nm。线性方程为f/f/f0＝0.0005c+1.0035，相关系数(r)为0.9982。根据3σ/k方程计算检测限(lod)为1.986nm(其中σ是空白溶液的标准偏差(n＝11)，k表示校准曲线的斜率)。

2.4、传感体系对检测物选择性的考察

为了评估开发的传感系统辨别能力，在相同条件下检测了k⁺、na⁺、mg²⁺、al³⁺、zn²⁺、fe³⁺、cu²⁺、hg2+、cr³⁺、co²⁺、ag⁺、ni⁺、mn²⁺、cd²⁺、pb²⁺对传感体系的响应。结果显示在图9a中，与pb²⁺相比，在相同浓度下其他金属离子的荧光增强很弱。体系对pb²⁺的高选择性可归因于铅离子与适体的强结合力。此外，将相同浓度的pb²⁺及其类似物混合进行实验，结果显示相同浓度的类似物不干扰pb²⁺检测(见图9b)。

应用例1实际样品检测

利用本发明所述传感体系检测稀释的人血清中的pb²⁺。结果见图10。

验证了本发明在检测具有复杂基质的实际样品人血清中pb²⁺的潜在应用。通过测量加标样品来评估所述方法的准确性。如表2所示，所提出方法的回收率为95％-110％，在可接受的范围内。结果表明，本发明所述的方法可用于定性或定量检测实际临床血液样品中的pb²⁺。

表2在1％人血清中atp的加标回收实验

序列表

<110>商丘师范学院

<120>一种用于检测人血清中pb2+浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法

<160>7

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>t30695

<400>1

gggtgggtgggtgggt16

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>z

<400>2

aaaccctcccacccaccc18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>ps2.m

<400>3

gtgggtagggcgggttgg18

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>pw17

<400>4

gggtagggcgggttggg17

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>agro100

<400>5

ggtggtggtggttgtggtggtggtgg26

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>eda2

<400>6

ctgggagggagggaggga18

<210>7

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>tba

<400>7

ggttggtgtggttgg15