本发明属于酶-高分子结合物
技术领域：
，尤其涉及一种信号放大的酶标二抗的制备方法。
背景技术：
：免疫酶标基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是最常用的技术。该方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。科研中被广泛应用的为直接酶标记法，该方法是将hrp分子直接标记于二抗上。因此需要普通的酶标二抗即可完成。实验简单，成本低，但是因为没有信号放大作用，灵敏度不高，也易出现背景。技术实现要素：本发明目的在于提供一种信号放大的酶标二抗的制备方法，以解决普通的酶标二抗标记是hrp酶分子直接和二抗进行结合，免疫信号不高，灵敏度低的技术问题。为实现上述目的，本发明的一种信号放大的酶标二抗的制备方法的具体技术方案如下：首先，以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(hrp)-igg为体系，以葡聚糖(dex)作为载体，制备dex-hrp-igg结合物，其目标是提高hrp/igg摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；其次，通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔igg的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度。本发明采用高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗，提高酶标效率，提高酶标二抗信号放大作用，提高检测灵敏度。具体制备过程如下：其中最优的方案为：高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗。一种信号放大的酶标二抗的制备方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤a1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于pbs中，加入naio4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤a2、odex-hrp合成，将hrp加碳酸盐缓冲液，立即加入所述步骤a1氧化葡聚糖混合，避光震荡；步骤a3、odex-hrp-igg合成，上述聚合物中加入羊抗兔/鼠igg混合，充分混匀后避光搅拌，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵；离心，弃上清。进一步，所述步骤a4、加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于pbs中；将上述溶液装入透析袋中，用pbs透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。进一步，在所述步骤a1和a2之间增加了hrp氧化，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤a1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于pbs中，加入naio4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤a2'、hrp氧化，将hrp溶解在ph4.4醋酸缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌，加入乙二醇，浑匀静置；然后用醋酸缓冲液，4℃透析过夜；步骤a2、odex-igg合成，将一部分氧化葡聚糖加入羊抗鼠/兔igg，室温震荡反应，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；加入乙二胺盐酸盐，震荡反应，加入氰基硼氢化钠，震荡反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤a3、odex-igg-ohrp合成，取上述反应液，加入氧化hrp和碳酸盐缓冲液，充分混匀后避光搅拌；往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，静置离心，弃上清；加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于pbs中；将上述溶液装入透析袋中，用pbs透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。进一步，在所述步骤a1和a2'之间增加了葡聚糖氨化，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行：步骤a1、葡聚糖氧化，在室温下将葡聚糖充分溶解于pbs中，加入naio4，避光震荡；加入乙二醇进行反应，取反应液用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤a2”、葡聚糖氨化，所述步骤a1透析好的葡聚糖加入乙二胺盐酸盐，震荡反应后，加入氰基硼氢化钠，再次震荡反应；而后用碳酸盐缓冲液透析过夜；步骤a2'、hrp氧化，将hrp溶解在醋酸缓冲液中，加入高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌一段时间，加入乙二醇，浑匀静置；然后用醋酸缓冲液，透析过夜。步骤a2、adex-ohrp合成，将所述步骤a2'得到的氧化hrp加碳酸盐缓冲液，然后立即加入氨化葡聚糖混合，室温避光震荡一段时间；再加入氰基硼氢化钠还原，震荡反应；碳酸盐缓冲液透析过夜。步骤a3、adex-ohrp-igg合成，取所述步骤a2”得到的氨化葡聚糖和步骤a2得到的hrp的结合物的一半，加入羊抗兔/鼠igg混合，充分混匀后避光搅拌，往溶液中加入氰基硼氢化钠，室温反应；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，离心，弃上清；加入半饱和硫酸铵清洗，最后沉淀物溶于pbs中。进一步，所述步骤a5、adex-ohrp-igg合成，取上述二分之一的结合物，加入戊二醛，室温静止过夜，逐步滴加羊抗鼠/兔igg，室温反应；将上述溶液装入透析袋中，用pbs透析过夜，加入抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。本发明的一种信号放大的酶标二抗的制备方法具有以下优点：以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(hrp)-igg为体系，以葡聚糖(dex)作为载体，制备dex-hrp-igg结合物，其目标是提高hrp/igg摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔igg的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度；polymer酶标二抗法，该方法采用一段聚合物做为载体链，将该多聚物与二抗结合，然后可再标记上多个hrp酶分子，实现高灵敏，低背景，操作简便，无需进行内源性生物素标记；通过以多聚物为载体标记多个hrp酶分子，该多聚物同步标记二抗，与一抗进行进行免疫反应测试，达到反应信号放大的目的。具体实施方式为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合实施例，对本发明一种信号放大的酶标二抗的制备方法做进一步详细的描述。以生物化学分析中广泛应用的酶标抗体辣根过氧化物酶(hrp)-igg为体系，以葡聚糖(dex)作为载体，制备dex-hrp-igg结合物，其目标是提高hrp/igg摩尔比，由此提高酶标抗体的检测灵敏度；通过最优的方式进行葡聚糖、辣根过氧化物酶、羊抗鼠/兔igg的结合，提高二抗酶标效率，扩大二抗信号扩大作用，提高检测灵敏度。本发明采用高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗，提高酶标效率，提高酶标二抗信号放大作用，提高检测灵敏度。具体制备过程如下：将高分子化合物与辣根过氧化物酶及二抗的结合，其中最优的方案为：高分子化合物进行氧化反应或者氧化氨化反应，而后结合辣根过氧化物酶以及二抗。实施例1：1：葡聚糖氧化(t500)在室温下将葡聚糖2mg(t500)，充分溶解于0.2ml0.01mol/lph7.4pbs中，加入100μl0.2mnaio4，4度避光震荡3小时。加入0.1ml0.69mol/l乙二醇反应4度震荡15min中止反应。取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。2：葡聚糖氨化(t500)上述透析好的葡聚糖加入50μl150mg/ml乙二胺盐酸盐，4度震荡反应2小时。加入200ul10mg/ml氰基硼氢化钠，4度震荡反应2小时。而后用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。3：hrp氧化将10mghrp溶解在2ml0.01mol/lph4.4醋酸缓冲液中，加入0.4ml0.1mol/l的高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入1ml0.16mol/l乙二醇，浑匀静置30分钟。然后用ph4.41mmol/l醋酸缓冲液，4℃透析过夜，期间透析液更换三次。4：adex-ohrp合成，将氧化hrp加400μl0.2mol/lph9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入2mg氨化葡聚糖混合，4度室温避光震荡2小时。再加入200μl10mg/ml氰基硼氢化钠还原，4℃震荡反应2小时。0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。5：adex-ohrp-igg合成，取氨化葡聚糖和hrp的结合物的一半，加入200ul5mg/ml羊抗兔/鼠igg混合，充分混匀后4度避光搅拌2h。往溶液中加入160μl10mg/ml氰基硼氢化钠，室温反应2小时。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。5000rpm离心0.5小时，弃上清。加入半饱和硫酸铵清洗一次，最后沉淀物溶于1ml0.01mol/lph7.4的pbs中。将上述溶液装入透析袋中，用0.01mol/lph7.4的pbs透析过夜，期间透析液更换三次，加入1ml抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。实施例2：1：葡聚糖氧化(t500)在室温下将葡聚糖2mg(t500)，充分溶解于0.2ml0.01mol/lph7.4pbs中，加入100μl0.2mnaio4，4度避光震荡3小时。加入0.1ml0.69mol/l乙二醇反应4度震荡15min中止反应。取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。2：odex-hrp合成，将5mghrp加400μl，0.2mol/lph9.5碳酸盐缓冲液，立即加入二分之一的氧化葡聚糖混合，4度避光震荡2小时。3：odex-hrp-igg合成，上述聚合物中加入200μl2..5mg/ml羊抗兔/鼠igg混合，充分混匀后4度避光搅拌2h。往溶液中加入10mg/ml氰基硼氢化钠80μl，室温反应2小时。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4度1小时。5000rpm离心0.5小时，弃上清。加入半饱和硫酸铵清洗一次，最后沉淀物溶于500μl0.01mol/lph7.4的pbs中。将上述溶液装入透析袋中，用0.01mol/lph7.4的pbs透析过夜，换液3次，加入1ml抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。实施例3：1：葡聚糖氧化(t500)在室温下将葡聚糖2mg(t500)，充分溶解于0.2ml0.01mol/lph7.4pbs中，加入100μl0.2mnaio4，4度避光震荡3小时。加入0.1ml0.69mol/l乙二醇反应4度震荡15min中止反应。取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。2：hrp氧化将10mghrp溶解在2ml0.01mol/lph4.4醋酸缓冲液中，加入0.4ml0.1mol/l的高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入1ml0.16mol/l乙二醇，浑匀静置30分钟。然后用ph4.41mmol/l醋酸缓冲液，4℃透析过夜，期间透析液更换三次。3：odex-igg合成，将四分之一氧化葡聚糖加入200ul2.5mg/ml羊抗鼠/兔igg，室温震荡反应2小时。往溶液中加入80μl4mg/ml氰基硼氢化钠，室温反应2小时。取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。加入25ul150mg/ml乙二胺盐酸盐，4℃震荡反应2小时，加入100μl10mg/ml氰基硼氢化钠，震荡反应2小时，取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。4：odex-igg-ohrp合成，取上述反应液，加入氧化hrp和40μl0.2mol/lph9.5碳酸盐缓冲液，充分混匀后4度避光搅拌2h。往溶液中加入10mg/ml氰基硼氢化钠160μl，室温反应2小时。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。5000rpm离心0.5小时，弃上清。加入半饱和硫酸铵清洗一次，最后沉淀物溶于1ml0.01mol/lph7.4的pbs中。将上述溶液装入透析袋中，用0.01mol/lph7.4的pbs透析过夜，换液3次，加入1ml抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。实施例4：1：葡聚糖氧化(t500)在室温下将葡聚糖2mg(t500)，充分溶解于0.2ml0.01mol/lph7.4pbs中，加入100μl0.2mnaio4，4度避光震荡3小时。加入0.1ml0.69mol/l乙二醇反应4度震荡15min中止反应。取反应液用0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。2：葡聚糖氨化(t500)上述透析好的葡聚糖加入50ul150mg/ml乙二胺盐酸盐，4度震荡反应2小时。加入200ul10mg/m氰基硼氢化钠，4度震荡反应2小时；0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。3：hrp氧化将10mghrp溶解在2ml0.01mol/lph4.4醋酸缓冲液中，加入0.4ml0.1mol/l的高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入1ml0.16mol/l乙二醇，浑匀静置30分钟。然后用ph4.41mmol/l醋酸缓冲液，4℃透析过夜，期间透析液更换三次。4：adex-ohrp合成将氧化hrp加400μl0.2mol/lph9.5碳酸盐缓冲液，然后立即加入2mg氨化葡聚糖混合，4度室温避光震荡2小时。再加入200μl10mg/ml氰基硼氢化钠还原，4℃震荡反应2小时。0.01mol/lph9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，期间透析液更换三次。5：adex-ohrp-igg合成取上述二分之一的结合物，加入1ml1.25％的戊二醛，室温静止过夜，逐步滴加12ul8.27mg/ml羊抗鼠/兔igg，室温反应3小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.01mol/lph7.4的pbs透析过夜，期间透析液更换三次，加入1ml抗体稀释液混匀，进行分装冰冻保存。对实施例1-实施例4得到的酶标二抗进行测试方法如下：取酶标二抗进行稀释，而后用相应属源igg进行elisa实验。elisa实验测试结果如下：名称酶标二抗稀释比od值实施例1102400倍1.374实施例2102400倍0.575实施例3102400倍0.438实施例4102400倍1.024阴性0.045由此可见实施例1，高分子化合物氧化后再氨化结合氧化的辣根过氧化物酶，然后聚合物再结合羊抗兔/鼠的igg的方式，二抗酶标记效率最高。实施例1，高分子化合物氧化后再氨化结合氧化的辣根过氧化物酶，然后聚合物再结合羊抗兔/鼠的igg的方式，二抗酶标记效率最高。结果表明实施例1，实施例4中葡聚糖氧化后氨化标记效率比实施例2，实施例3中没有氨化的实验组高。氨化的葡聚糖更易与其他含醛基的物质反应。同时实施例4中戊二醛的添加影响葡聚糖复合物与igg的直接结合，从而可能影响了一个酶标记效率。可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。当前第1页12