一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法与流程

本发明属于荧光光信号测量技术领域，尤其涉及一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法。

背景技术：

传统的光学显微镜由于光的衍射现象导致了分辨率极限的存在，一般为侧向200nm左右，轴向500nm左右。而近年来基于单分子定位的超分辨显微成像技术能够突破这种分辨率限制。这种成像技术依赖于对单个分子的荧光光信号的精确定位，而对单分子进行轴向定位的精度直接影响到三维成像的分辨能力。通常的轴向定位方式是在光路中加入柱面镜引入像散，或者进行双层面成像，通过单分子图像的形状判断轴向位置。这种定位方法通常精度远低于xy方向的定位精度，因此导致三维水平的分辨率较低。同时还有一种定位方法，使用两个显微物镜对样品同时成像，并将单分子荧光进行干涉，使用干涉测量的方式进行定位，这种方式能够极大地提高轴向定位精度，但是光路复杂，对稳定性要求很高，而且荧光的干涉距离很短，导致每次更换样品之后干涉的两条光路需要精细调节光程差。因此，解决上述问题对单分子定位和超分辨荧光荧光显微成像具有重要的意义和应用价值。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明公开了一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法，通过使用激发光干涉测量的方式进行单分子定位，用于解决现有技术中轴向定位精度低的问题，同时也可以解决使用干涉测量存在的干涉距离过短，光路需要不断调整的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置，包括：

光源系统，其用于提供激发光；

照明及调制系统，其与所述光源系统光路连接，所述照明及调制系统用于将激光分为两个光路并在样品处汇聚产生干涉图样，同时调制图样的相位；

显微成像系统，其与所述照明及调制系统光路连接，所述显微成像系统用于收集样品产生的光信号并将收集的光信号汇聚到光电传感器的不同区域；

信号控制处理系统；其分别与光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统连接，以对光源系统、照明及调制系统、显微系成像系统进行同步有序控制。

作为上述技术方案的进一步描述：所述光源系统包括激光器，在激光器的光路上依次设置有强度调制器和1/2波片，通过激光器发出的激光经过强度调制器控制光强，通过1/2波片控制偏振状态后进入到调制系统中。

作为上述技术方案的进一步描述：所述强度调制器为声光调制器。

作为上述技术方案的进一步描述：所述照明及调制系统包括电光调制器和偏振分光镜，由所述光源系统发出的激光经过所述电光调制器调制光束中两个偏振态之间的相位差，之后经过所述偏振分光镜将两个偏振态分离形成光路a和光路b。

作为上述技术方案的进一步描述：所述光路a上依次设有第一扩束器、第一反射镜、第二反射镜、第一聚焦透镜和第三反射镜；所述光路b上依次设有第二扩束器和第二聚焦透镜。

作为上述技术方案的进一步描述：所述显微成像系统包括样品、显微物镜、二向色分光镜、第三聚焦透镜、第四反射镜、光阑、第四聚焦透镜、第五聚焦透镜、谐振扫描镜、第一共轭透镜组、第二共轭透镜组和光电传感器；所述二向色分光镜、显微物镜、样品在同一光路上；所述二向色分光镜的分光路上依次设有第三聚焦透镜、光阑、第四透镜、第五透镜、谐振扫描镜；所述谐振扫描镜的另一条光路上依次设有第一共轭透镜组、第二共轭透镜组和光电传感器。

作为上述技术方案的进一步描述：所述第一共轭透镜组和第二共轭透镜组各包含n个分透镜，所述n个分透镜用于不同相位下的荧光光信号收集。

作为上述技术方案的进一步描述：所述激光器光源为连续、单纵模的光源；各个调制器的转换频率至少1mhz；谐振扫描镜扫描频率至少4khz。

作为上述技术方案的进一步描述：所述光路a从所述显微成像系统的样品上方进入样品；所述光路b进入所述成像系统的二向色分光镜，通过显微成像系统的显微物镜进入样品。

一种根据上述所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置的工作方法，包括如下步骤：

a、首先将样品调整到显微物镜焦平面上；

b、然后打开光源系统发射出激发光，激发光被照明及调制系统分为两路激光并在样品处产生干涉条纹，同时激发样品；

c、样品所发出的光信号经过显微成像系统进行收集，并汇聚在谐振扫描镜镜面上，经谐振扫描镜快速扫描，通过n组共轭透镜组中的第一组透镜汇聚到光电传感器靶面子区域位置1处，然后对荧光光信号进行积分；然后照明及调制系统改变激发光相位并激发样品，样品发射出光信号通过显微成像系统收集后汇聚在谐振扫描镜镜面镜面上，经谐振扫描镜镜面快速扫描，通过n组共轭透镜组中的第二组透镜汇聚到光电传感器靶面子区域位置2处，然后对荧光光信号进行积分，依次循环，照明及调制系统改变激发光相位n次，完成一个周期；

d、在光电传感器曝光过程中，重复步骤c若干个周期，最终在曝光结束得到荧光图像；其中，所述荧光图像包含n个荧光子图像；

e、根据得到的荧光子图像中同一个单分子在不同荧光子图像中的亮度计算单分子的相位，并通过相位转换为轴向位置，实现对单分子的轴向定位。

作为上述技术方案的进一步描述：所述荧光光信号聚焦在谐振扫描镜镜面上，并且谐振扫描镜镜面处于共轭透镜组的焦点处。

作为上述技术方案的进一步描述：所述显微成像系统与照明及调制系统同步控制，光信号投射在光电传感器每个子区域上时，照明及调制系统将样品处的干涉图样调制到对应的相位。

作为上述技术方案的进一步描述：当样品发射的光信号处于共轭透镜组中透镜的交界处时，激发光处于关闭状态；当样品发射的光信号完全位于某一组共轭透镜组中透镜的通光孔径内时，激发光处于打开状态。

本发明具有如下有益效果：

本发明提出了一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置及其工作方法，即激发光分为两路从相对位置照射样品，在样品处产生轴向干涉同时对样品的荧光分子进行激发。通过照明图案的相位和光源强度快速切换，实现不同相位的图像同时采集，然后对单分子在不同照明图案下的亮度计算其相对于照明条纹的相位，再通过相位对位置进行解析，从而实现更高的轴向定位精度。利用该技术可以实现对单分子的轴向位置测量，相比以往的定位方法具有精度高且不受干涉长度的影响等优点。

附图说明

图1为本发明提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的结构示意图；

图2为本发明提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的图像采集流程示意图；

图3为本发明提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置的工作方法中图像处理流程示意图；

图4为本发明提供的一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置采集的每幅荧光图像中得到的三个荧光子图像。

其中：1-光源系统；2-照明及调制系统；3-显微成像系统；4-信号控制处理系统；1-1-激光器；1-2-声光调制器；1-3-1/2波片；2-1-电光调制器；2-2-偏振分光镜；2-3-第一扩束器；2-4-第一反射镜；2-5-第二反射镜；2-6-第一聚焦透镜；2-7-第三反射镜；2-8-第二扩束器；2-9-第二聚焦透镜；3-1-样品；3-2-显微物镜；3-3-二向色分光镜；3-4-第三聚焦透镜；3-5-第四反射镜；3-6-光阑；3-7-第四聚焦透镜；3-8-第五聚焦透镜；3-9-谐振扫描镜；3-10-第一共轭透镜组；3-11-第二共轭透镜组；3-12-光电传感器。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、本发明解决了传统单分子轴向定位方法定位精度低的问题，通过激发光干涉测量提供更高的轴向定位精度；

2、本发明解决了使用单分子荧光干涉定位方法存在的系统光路复杂，荧光干涉长度短以及每次更换样品之后需要对光路进行调节等问题，保证了样品处稳定可靠且对比度高的干涉条纹，提高了测量的稳定性和精度。

如图1所示，一种基于干涉测量的单分子轴向定位装置，包括光源系统1、照明及调制系统2、显微成像系统3和信号控制处理系统4；其中，光源系统1用于提供激发光；其中，照明及调制系统2与光源系统1光路连接，照明及调制系统2用于将激光分为两个光路并在样品处汇聚产生干涉图样，同时调制图样的相位；其中，显微成像系统3与照明及调制系统2光路连接，显微成像系统3用于收集样品产生的光信号并将收集的光信号汇聚到光电传感器的不同区域；信号控制处理系统4分别与光源系统1、照明及调制系统2、显微系成像系统3连接，以对光源系统1、照明及调制系统2、显微系成像系统3进行同步有序控制。

在本实施例中，所述光源系统1包括激光器1-1，在激光器1-1的光路上依次设置有强度调制器和1/2波片1-3；通过激光器1-1发出的激光经过强度调制器控制光强，优选的，强度调制器为声光调制器1-2；通过1/2波片1-3控制偏振状态后进入到照明及调制系统2中。

在本实施例中，所述照明及调制系统2包括电光调制器2-1和偏振分光镜2-2，由光源系统1发出的激光经过电光调制器2-1调制光束中两个偏振态之间的相位差，之后经过偏振分光镜2-2将两个偏振态分离形成光路a和光路b；

其中，所述光路a上依次设有第一扩束器2-3、第一反射镜2-4、第二反射镜2-5、第一聚焦透镜2-6和第三反射镜2-7；所述光路b上依次设有第二扩束器2-8和第二聚焦透镜2-9。

在本实施例中，所述显微成像系统3包括样品3-1、显微物镜3-2、二向色分光镜3-3、第三聚焦透镜3-4、第四反射镜3-5、光阑3-6、第四聚焦透镜3-7、第五聚焦透镜3-8、谐振扫描镜3-9、第一共轭透镜组3-10、第二共轭透镜组3-11和光电传感器3-12；所述二向色分光镜3-3、显微物镜3-2、样品3-1在同一光路上；所述二向色分光镜3-3的分光路上依次设有第三聚焦透镜3-4、第四反射镜3-5、光阑3-6、第四聚焦透镜3-7、第五聚焦透镜3-8、谐振扫描镜3-9；所述谐振扫描镜3-9的另一条光路上依次设有第一共轭透镜组3-10、第二共轭透镜组3-11和光电传感器3-12。

在本实施例中，所述第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-12各包含n个分透镜，所述n个分透镜用于不同相位下的荧光光信号收集。

在本实施例中，所述激光器1-1发射的光源为连续、单纵模光源；各个调制器的转换频率至少1mhz；谐振扫描镜3-9扫描频率至少4khz。

在本实施例中，所述光路a从所述显微成像系统的样品3-1上方进入样品；所述光路b进入所述成像系统的二向色分光镜3-3，通过显微成像系统的显微物镜3-2进入样品3-1。

如图2所示，一种根据上述所述的基于干涉测量的单分子轴向定位装置的工作方法，包括如下步骤：

1、信号控制处理系统4控制激光器1-1发出激光，经过声光调制器1-2控制激光的光强输出，经过1/2波片1-3调节光束中两种偏振态的比例，通过电光调制器2-1调制两种偏振态之间的相位差m1，然后通过偏振分光镜2-2分为两个不同偏振方向的激光子光束a和b。

激光子光束a经过第一扩束器2-3进行扩束，通过第一反射镜2-4、第二反射镜2-5、第一聚焦透镜2-6和第三反射镜2-7后汇聚在样品3-1处；激光子光束b通过第二扩束器2-8进行扩束后，通过第二聚焦透镜2-9、二向色分光镜3-3和显微物镜3-2照射在样品3-1处。激光子光束a和b在样品3-1处汇聚产生对应相位m1的干涉条纹同时激发样品发射荧光光信号；荧光光信号经显微物镜3-2、二向色分光镜3-3、第三聚焦透镜3-4、第四反射镜3-5、光阑3-6、第四聚焦透镜3-7和第五聚焦透镜3-8汇聚在谐振扫描镜3-9的镜面上，然后通过谐振扫描镜3-9进行扫描，然后通过对应的第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-11下对应的分透镜，汇聚在光电传感器3-12靶面位置n1处；

信号控制处理系统4控制电光调制器2-1改变激光相位m2，然后通过偏振分光镜2-2分为两个不同偏振方向的激光子光束a和b。激光子光束a经过第一扩束器2-3进行扩束，通过第一反射镜2-4、第二反射镜2-5、第一聚焦透镜2-6和第三反射镜2-7后汇聚在样品3-1处；激光子光束b通过第二扩束器2-8进行扩束后，通过第二聚焦透镜2-9、二向色分光镜3-3和显微物镜3-2照射在样品3-1处。激光子光束a和b在样品3-1处汇聚产生对应相位m2的干涉条纹同时激发样品发射荧光光信号；荧光光信号经显微物镜3-2、二向色分光镜3-3、第三聚焦透镜3-4、第四反射镜3-5、光阑3-6、第四聚焦透镜3-7和第五聚焦透镜3-8汇聚在谐振扫描镜3-9的镜面上，然后通过谐振扫描镜3-9进行扫描，然后通过对应的第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-11下对应的分透镜，汇聚在光电传感器3-12靶面位置n2处；

信号控制处理系统4控制电光调制器2-1改变激光相位m3，然后通过偏振分光镜2-2分为两个不同偏振方向的激光子光束a和b。激光子光束a经过第一扩束器2-3进行扩束，通过第一反射镜2-4、第二反射镜2-5、第一聚焦透镜2-6和第三反射镜2-7后汇聚在样品3-1处；激光子光束b通过第二扩束器2-8进行扩束后，通过第二聚焦透镜2-9、二向色分光镜3-3和显微物镜3-2照射在样品3-1处。激光子光束a和b在样品3-1处汇聚产生对应相位m3的干涉条纹同时激发样品发射荧光光信号；荧光光信号经显微物镜3-2、二向色分光镜3-3、第三聚焦透镜3-4、第四反射镜3-5、光阑3-6、第四聚焦透镜3-7和第五聚焦透镜3-8汇聚在谐振扫描镜3-9的镜面上，然后通过谐振扫描镜3-9进行扫描，然后通过对应的第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-11下对应的分透镜，汇聚在光电传感器3-12靶面位置n3处；一个周期扫描完成。

谐振扫描镜3-9以固定频率进行扫描，荧光光信号依次通过第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-11下对应的分透镜汇聚到光电传感器3-12靶面的不同位置，信号控制处理系统4同步谐振扫描镜3-9和声光调制器2-1、电光调制器2-1，使得荧光光信号在不同子区域上时调制样品处干涉条纹为对应的相位，同时当谐振扫描镜3-9的荧光光束处于第一共轭透镜组3-10和第二共轭透镜组3-11的透镜边沿时关闭激光。在一个曝光时间内如此往复，曝光结束后进行信号转换和传输。

在一个曝光周期内，包含扫描循环谐振扫描镜3-9扫描若干次，对于同一相位下的干涉条纹，其对应的荧光光信号在光电传感器3-12靶面的对应部分进行积分。最终在一个曝光周期内每幅荧光图像中能够得到三个荧光子图像(如图4所示)，分别对应三种不同的激发干涉条纹图案。以光电传感器3-12的曝光时间为100ms，谐振扫描镜3-9扫描频率4khz为例，谐振扫描镜3-9将进行400个扫描循环，实现每个相位条纹下的荧光光信号积分800次。

信号控制处理系统4根据得到的图像进行信号处理(如图3所示)。首先根据得到的荧光图像，通过一个单分子在每幅图像中三个子图像的亮度，根据二维高斯拟合计算出单分子的粗略轴向位置以及每个单分子所在位置的照明条纹的相位信息，通过这两种数据将相位与中心位置进行配准、计算得到单分子的精确位置信息。

此实施例通过一系列的措施实现了光信号轴向的高精度定位，本发明提供的基于干涉测量的单分子轴向定位装置和方法，以干涉条纹图案激发荧光光信号，实现同步和数据采集，与常规定位方法相比最大化避免因荧光分子闪烁、漂白、发光周期短导致的定位误差，保证超高精度定位信息的获取。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。