一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法与流程

本发明属于比色检测方法领域，具体地说是一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法。

背景技术：

比色技术已成为化学和生物传感领域中备受关注的技术，通过肉眼轻松地进行视觉判断，操作过程简单，并且无需复杂的设备。基于纳米粒子的比色方法由于其出色的局部表面等离子体共振和高消光系数而获得了巨大的发展。特别是基于纳米粒子存在状态即从分散到聚集的变化，以及颜色变化的比色方法被广泛应用于金属离子、dna、小分子、蛋白分子、细菌等的检测分析。

为了获得高灵敏度，不同的信号放大技术被用于以适配体为基础的比色生物传感器。如杂链反应(hcr)，聚合酶链反应(pcr)，工具酶和滚环扩增(rca)。在这些信号扩增策略中，基于工具酶辅助的信号扩增技术由于操作简单、灵敏度和特异性高、反应时间相对较短等优点，近年来在生化分析中得到了迅速发展。在这些信号扩增策略中，核酸酶辅助信号扩增技术结合核酸酶水解、适配体和纳-米技术的循环效应而设计，因其操作简单、灵敏度和特异性高、反应时间相对较短等优点，在生化分析中应用较多。

研究者曾报道了采用核酸适配体作为识别分子检测卡那霉素，无信号放大进行检测，然而该方法的吸光度响应较小，传感的灵敏度低(0.53nm)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法，包括以下步骤：

步骤1，以dsdna探针作为识别分子，dsdna探针与待测目标物作用后变为单链dna；

步骤2，利用exoi特异性水解单链dna的特性，将待测目标物分子释放出来进入下一轮反应，进而实现信号放大；

步骤3，将聚阳离子加入溶液中与剩余的dsdna探针作用；

步骤4，加入负电荷的纳米粒子，使其与体系中剩余的聚阳离子反应，获得目标物的浓度。

优选地，所述dsdna探针包括：与目标物特异性作用的核酸适配体和cdna分子。

优选地，所述dsdna探针的长链为目标物的识别分子，其短链为与其部分互补的单链dna。

优选地，所述短链的长度为长链长度的3/5-4/5。

优选地，所述聚阳离子为含有正电荷的聚合物或含有正电荷的蛋白分子。

优选地，所述带正电荷的聚合物为聚苯乙烯磺酸钠、聚天冬酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺。

优选地，所述带正电荷的蛋白分子为鱼精蛋白。

优选地，所述带负电荷的纳米粒子为带负电贵金属纳米球、纳米棒、纳米三角、纳米梭子。

优选地，所述待测目标物为金属离子、有机小分子、蛋白分子、细胞、细菌或病毒

本发明采用部分互补的双链dna(dsdna)探针作为识别分子，dsdna探针与目标物作用后变为单链dna，利用exoi能够特异性水解单链dna的特性，将目标物释放出来进入下一轮反应，进而实现信号放大，而后将聚阳离子加入溶液中与剩余的dsdna探针作用，再加入负电荷的纳米粒子，使其与体系中剩余的聚阳离子反应，从而引起纳米粒子紫外吸收强度的变化，进而获得目标物的浓度。

本发明具有以下优点：

(1)本发明所采用的识别分子可以根据目标物的改变而改变，理论上任何物质都有其相应的对该种物质具有选择性识别特性的核酸适体，这极大的增大了本发明的应用范围。

(2)本发明采用纳米粒子作为比色传感方法的信号指示，其合成方法简单、稳定性好、颜色变化明显，易于肉眼观察。

(3)本发明以聚阳离子作为中间媒介，它能够有效地分别与核酸适体和纳米粒子发生静电相互作用，大大降低了方法的检出限，提高体系灵敏度。

(4)本发明以核酸外切酶i辅助进行信号放大，exoi可以特异性水解与靶标适配体互补的单链dna和靶标适配体，破坏靶标-适配体复合物的结构。释放出的靶标分子结合下一个探针而引发新的酶切过程，从而实现信号放大。

附图说明

图1为本发明实施例实验现象图及表征图；

图2为本发明聚阳离子鱼精蛋白的浓度优化图；

图3为本发明dsdna探针浓度优化图；

图4为本发明测定不同浓度卡那霉素的标准曲线图及标准曲线方程数据图；

图5为本发明测定牛奶样品中不同浓度卡那霉素的标准曲线图及标准曲线方程数据图；

图6为本发明方法原理示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

实施例

本实施例一种基于核酸外切酶信号放大的比色检测方法，以部分互补的双链dna(dsdna)探针作为识别分子，dsdna探针与目标物作用后变为单链dna,利用exoi能够特异性水解单链dna的特性，将目标物分子释放出来进入下一轮反应，实现体系的信号放大，其过程见附图6所示。

方法具体步骤以下：

步骤1，以dsdna探针作为识别分子，dsdna探针与待测目标物作用后变为单链dna；

步骤2，利用exoi特异性水解单链dna的特性，将待测目标物分子释放出来进入下一轮反应，进而实现信号放大；

步骤3，将聚阳离子加入溶液中与剩余的dsdna探针作用；

步骤4，加入负电荷的纳米粒子，使其与体系中剩余的聚阳离子反应，获得目标物的浓度。

以部分互补的双链dna(dsdna)探针作为识别分子，dsdna探针与目标物作用后变为单链dna,利用exoi能够特异性水解单链dna的特性，将目标物分子释放出来进入下一轮反应，实现体系的信号放大。

本实施例以测定卡那霉素(kanamycin)为例。

比色法检测卡那霉素的实验原理：kanamycin能够与dsdna探针中的卡那霉素适配体(kanaapt)特异性结合。在核酸外切酶i辅助的kanamycin循环放大中，kanamycin与kanaapt形成的复合物被核酸外切酶i识别并将kanaapt和cdna剪切，在剪切kanaapt的同时释放出kanamycin。释放出的kanamycin结合下一个dsdna探针而引发新的酶切过程，从而实现信号放大，其实现结果见附图1所示，其中a为无卡那霉素，b为有卡那霉素。

其测定步骤如下：

卡那霉素缓冲液成分

50mmnacl和2.5mmmgcl2的10mmhepes缓冲溶液(ph＝7.4)。

(1)合成dsdna探针

将kanaapt与cdna按1:1的比例混合，用tebuffer将其稀释至四倍，将稀释后的核酸适体溶液在95℃下解链10min，之后经历24h内缓慢降温至25℃的退火过程。

(2)金纳米粒子的合成

采用柠檬酸三钠还原法，步骤为：将10ml,38.8mm的柠檬酸钠快速加入到含有1mm，100ml的氯金酸沸水溶液中。在此期间，溶液的颜色由黄色逐渐变为浅灰色，最后变为酒红色时，持续沸腾30min后停止加热。待溶液冷却至室温时，将其放置于4℃冰箱中避光保存。

(3)配置牛奶处理液

首先，将乙酸溶液(20％，v/v)滴加到牛奶样品中，直到ph调整至4.6，从而使牛奶中的蛋白质(主要是酪氨酸)在等电点变性并沉淀；然后，将样品置于45℃的水浴中10min，以确保蛋白质完全沉淀；之后，将样品以10000rpm离心30min，然后去除含有变性蛋白质和脂肪的沉淀物；随后，将上清液通过0.22μm超滤膜(pvdf)过滤以除去脂质，并将滤液调节至中性ph以进一步检测。

(4)鱼精蛋白浓度测定

根据金纳米粒子吸光度值的变化，选择最佳浓度，以能够使金纳米粒子最大程度发生团聚的浓度为宜，鱼精蛋白的浓度参见图2。具体为配制一系列不同浓度(0、0.5、1、1.5、2μg/ml)的鱼精蛋白溶液，然后分别加入400μl金纳米粒子溶液。

(5)dsdna探针浓度测定

本实施例中，根据金纳米粒子吸光度值的变化，选择最佳浓度，以使金纳米粒子最大程度不发生团聚浓度为宜，dsdna探针的浓度参见图3。具体为配制一系列不同浓度(0、0.5、1、1.5、2μm)的dsdna探针，与优化的鱼精蛋白混合反应10min，然后加入400μl金纳米粒子溶液。

(6)绘制工作曲线

配制系列已知浓度的卡那霉素标准溶液(10^-13、10^-12、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7m)，与dsdna探针和核酸外切酶i在37℃下反应60min，然后在80℃下灭活20min。为了避免鱼精蛋白在较高温度下失活，将反应后的溶液置于冷水中冷却至室温。接着加入鱼精蛋白溶液反应10min，最后加入金纳米粒子反应10min。记录不同时间下的吸光度值，即得金纳米粒子在不同浓度卡那霉素溶液中的紫外可见吸收信号响应曲线(参见图4)。如图4a，b所示随着卡那霉素浓度的增加，在波长520nm处，aunps的紫外吸收强度降低，而在波长650nm处峰值升高，同时，颜色逐渐由红色变为蓝色，如图4-c所示。实验结果表明，吸收比值(a650/a520)与卡那霉素的浓度在10^-13～10^-7m范围内呈现出良好的线性相关性(r²＝0.994)，检出限为10^-13m。

(7)检测牛奶中卡那霉素

使用标准加入法，利用稀释10倍的牛奶处理液作为溶剂，配制不同浓度的卡那霉素标准溶液(10^-12、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7m)；其余制备以及检测操作步骤与前文中所述步骤无变化；对牛奶中卡那霉素检测。

图5为本发明测定牛奶样品中不同浓度卡那霉素的标准曲线图及标准曲线方程数据图。如图5a,5b所示，随着卡那霉素浓度的增加，在波长520nm处，aunps的紫外吸收强度降低，而在波长650nm处峰值升高，同时，颜色逐渐由红色变为蓝色，如图5c所示。实验结果表明，吸收比值(a650/a520)与卡那霉素的浓度在10^-13～10^-7m/l范围内呈现出良好的线性相关性(r²＝0.992)，检出限为10^-12m。

本发明具有以下优点：

(1)本发明所采用的识别分子可以根据目标物的改变而改变，理论上任何物质都有其相应的对该种物质具有选择性识别特性的核酸适体，这极大的增大了本发明的应用范围。

(2)本发明采用纳米粒子作为比色传感方法的信号指示，其合成方法简单、稳定性好、颜色变化明显，易于肉眼观察。

(3)本发明以聚阳离子作为中间媒介，它能够有效地分别与核酸适体和纳米粒子发生静电相互作用，大大降低了方法的检出限，提高体系灵敏度。

(4)本发明以exoi辅助进行信号放大，exoi可以特异性水解与靶标适配体互补的单链dna和靶标适配体，破坏靶标-适配体复合物的结构。释放出的靶标分子结合下一个探针而引发新的酶切过程，从而实现信号放大。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。