一种用于检测脓毒症标记物降钙素原的电化学传感器的制备方法

本发明涉及电化学传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测脓毒症标记物降钙素原的电化学传感器的制备方法。

背景技术：

脓毒症是一种潜在的致命或改变生命的综合征，其中身体对感染的反应是全身免疫反应。许多人认为脓毒症有三个阶段，从脓毒症开始，发展到严重脓毒症和脓毒性休克。目前脓毒症约有30％-70％的脓毒症患者因多器官衰竭而无法存活。因此，脓毒症的早期、及时、特异的治疗是重要的，也是临床上必要的。

降钙素原(proct，proclacitonin)是一种脓毒症诱导蛋白，它是无激素活性的降钙素前肽物质，它可作为一种感染炎症的标志物，用于区分细菌性感染和病毒性感染，并判断细菌性感染的严重程度和预后检测。proct与常规用于炎症诊断的指标相比，已被公认为最理想的诊断严重细菌感染的指标，并且目前proct有广泛的临床应用，例如自身免疫疾病的监测、器官移植的监测、脓毒症监测、急性胰腺炎监测等。

目前，基于常规方法的proct检测方法已经报道了很多，包括血培养(bc)、分子诊断技术、基于pcr的方法、质谱和蛋白质微阵列。但这些方法均存在仪器设备高、劳动强度大、样品制备复杂、耗时长等缺点。而电化学检测方法因其灵敏度高、成本低、耗时短等优点而备受关注。然而，对于电化学传感器来说，设计一个高灵敏度和高选择性的识别系统是能够有效提高检测效率与灵敏度的一个方向。

近年来，二维石墨相氮化碳(g-c3n4)作为一类新型的碳纳米材料，以其比表面积大、不含金属、易于合成、热稳定性、低毒性和低成本等显著特点逐渐出现在人们的视线中。g-c3n4在药物传递、肿瘤成像和传感过程中引起了全世界的关注。然而，g-c3n4的宽禁带限制了其在电化学应用中的应用。为此，人们提出了几种方法，如掺杂杂质、与典型半导体耦合和纳米结构合成。

而剥离体g-c3n4ns比普通的g-c3n4具有更好的电化学活性和稳定性，因此采用剥离体g-c3n4-ns来进行制备用于检测脓毒症的电化学传感器是一个很有前景的方向。

技术实现要素：

因此，基于以上背景，本发明提供了一种基于剥离体石墨相氮化碳(g-c3n4ns)修饰工作电极的用于检测脓毒症标记物降钙素原的电化学传感器的制备方法，所制备的电化学传感器具有更高的灵敏度，与特异性选择性。

本发明的技术方案为：一种用于检测脓毒症标记物降钙素原的电化学传感器的制备方法，其包括如下步骤：

s1：以尿素为原料，将尿素通过高温煅烧的方式合成制备得到氮化碳粉末；

s2：将步骤s1所得的氮化碳粉末利用超声波熔解方式，通过溶解、剥离，制备得到石墨相氮化碳；

s3：将步骤s2所制备的石墨相氮化碳，利用π-π堆叠的方式，将其修饰到电极的表面；

s4：将能够对降钙素原特异性识别的多肽探针(pp)修饰到步骤s3中经过修饰后的玻碳电极表面后，再用牛血清蛋白进行封闭，即可制备得到可用来检测脓毒症的电化学传感器。

进一步地，步骤s3、s4所修饰的电极为工作电极。

进一步地，所述的电化学传感器的系统为以玻碳为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂为对电极。

进一步地，上述步骤s1中的氮化碳粉末的制备步骤为：

1)先将称取一定的尿素放置在石英陶瓷坩埚中后，将其放置在管式炉中以5℃/min升温至550℃，

2)将石英陶瓷坩埚在常压下以550℃保温3小时；

3)将石英陶瓷坩埚冷却至室温下后，收集石英陶瓷坩埚中的产物，即可制备得到氮化碳粉末。

进一步地，上述步骤s2中的石墨相氮化碳的制备步骤为：

1)将步骤s1制备的氮化碳粉末分散在乙醇中，并对混合液进行超声处理1h；

2)将步骤1)中经过超声处理的混合物进行静置，待大颗粒的石墨相氮化碳完全沉于乙醇溶液底部，收集分散均匀的剥离后的石墨相氮化碳分散液体。

进一步地，上述步骤s3中的石墨相氮化碳的修饰玻碳电极的步骤为：

1)先将玻碳电极用氧化铝粉进行抛光，然后用蒸馏水连续冲洗数次；

2)将步骤s2中收集的剥离后的石墨相碳化氮分散液滴注在玻碳电极表面，室温干燥30min即可。

进一步地，上述步骤s4的制备步骤为：

1)将肽粉溶解在tris-hcl中后，将用脯氨酸修饰的合成肽滴到步骤s3经过石墨相氮化碳修饰后的玻碳电极表面后，在室温下培养1h后，依次用tris-hcl、去离子水冲洗玻碳电极表面以除去未结合的合成肽即可。

采用上述技术方案，具有的有益效果如下：

本发明中所制备的电化学传感器，通过将玻璃体石墨相氮化碳修饰到玻碳电极表面上，能够在检测时增加比表面积和电子传递能力，且将能够特异性识别降钙素原的多肽探针修饰至玻碳电极上，能够从多方便来能够提高传感器检测的灵敏度、精确度、特异选择性，其对降钙素原的检测灵敏度能够达到0.15fg/ml。

附图说明

图1为本发明的制备流程示意图；

图2为本发明原子力显微镜对g-c3n4和pp/g-c3n4对电极修饰的形态表征；

图3为本发明实施例中经过g-c3n4和pp/g-c3n4修饰后的玻碳电极的电化学性能表征结果；

图4为采用实施例的电化学传感器对不同浓度的降钙素原的检测结果；

图5为本发明实施例的电化学传感器的特异性选择的验证结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：一种用于检测脓毒症的电化学传感器的制备方法，其制备步骤如下(制备流程见图1)：

s1：氮化碳粉末制备：

1)先将称取0.25g的尿素放置在石英陶瓷坩埚中后，将其放置在管式炉中以5℃/min升温至550℃，

2)将石英陶瓷坩埚在常压下以550℃保温3小时；

3)将石英陶瓷坩埚冷却至室温下后，收集石英陶瓷坩埚中的产物，即可制备得到氮化碳粉末。

s2：石墨相氮化碳的制备

1)称取上述步骤s1制备的0.001g氮化碳粉末，并将其分散在2ml的乙醇(hplc级)中，并对混合液进行超声处理1h；

2)将步骤1)中经过超声处理的混合物进行静置，待大颗粒的石墨相氮化碳完全沉于乙醇溶液底部，收集分散均匀的剥离后的石墨相氮化碳分散液体。

s3：石墨相氮化碳的修饰玻碳电极

1)先将直径为3mm的玻碳电极用氧化铝粉抛光布进行抛光，然后用蒸馏水连续冲洗数次；

2)将步骤s2中收集的剥离后的10μl石墨相碳化氮分散液滴注在玻碳电极表面，室温干燥30min即可。

s4：探针修饰玻碳电极

1)将25mg肽粉溶解在1ml的tris-hcl中后，制备出最终浓度为500um的溶液，然后将终浓度为500mm，50μl经过脯氨酸修饰后的合成肽滴到步骤s3经过石墨相氮化碳修饰后的玻碳电极表面后，在室温下培养1h后，依次用1×tris-hcl(ph为7.4)、去离子水冲洗玻碳电极表面以除去未结合的合成肽即制备出用于检测脓毒症的电化学传感器。

本实施例中的电化学传感器系统以玻碳为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂为对电极。

本实施例中的尿素、nacl采购于solarbio公司，tris-hcl、去离子水、牛血清白蛋白(bsa)均采购于solarbio公司(北京)，降钙素原采购于cusag公司(中国，武汉)。

本实施例对传感器的制备过程及检测结果进行了一系列的表征及验证，其表征结果如下：

1、利用原子力显微镜对g-c3n4和pp/g-c3n4的改性过程中玻碳电极的表面的形态进行表征，其表征结果见图2，从图2(a)的未修饰前的玻碳电极的表征图片可以看出，未修饰前的玻碳电极表面呈现相对均匀的扁平结构，图2(b)图2(c)中表征结果可以看到经过g-c3n4和pp/g-c3n4修饰后的玻碳电极，由于g-c3n4和pp/g-c3n4的π-π堆叠效应，玻碳电极表面的形貌发生了明显的变化，从图2(b)可以看出经过g-c3n4修饰的玻碳电极的表面的结构就像是一个充满球形孔隙的薄煎饼，因此可以确定g-c3n4已经成功修饰到了玻碳电极上；从图2(c)中可以看出，在将pp溶液滴加至g-c3n4修饰后的玻碳电极表面后，电极表面发生了明显的变化，图中的亮点和高增加显示了pp已经牢固的结合在了电极上。

2、采用循环伏安法(cv)、微分脉冲伏安法(dpv)和电化学阻抗法(eis)三种方式对采用g-c3n4和pp/g-c3n4修饰的玻碳电极的电化学性能进行表征，结果见图3。图3(a)为循环伏安法(cv)的表征结果，其表征过程中的扫描速率为100mv/s，从图3(a)中可以看出背景电流随着g-c3n4和pp的修饰而减小，以此表明g-c3n4/gce和pp/g-c3n4/gce的形成；同时采用了dpv技术来识别修饰步骤，从图3(b)可以明显看出，峰值电流随着修饰的深入呈现降低的趋势，此显示了g-c3n4和pp进行了成功耦合，从图3(c)为玻碳电极逐步修饰过程中的阻抗变化，图中显示了未修饰玻碳电极、gc3n4/gce和pp/gc3n4/gce的阻抗在nyquist图上几乎呈直线，随后修饰电极时的电荷转移电阻，表明了gc3n4和pp逐渐固定在玻碳电极表面，形成了额外的阻挡层，可以阻止电极与氧化还原探针之间的电子交换。

3、采用本发明的电化学传感器对不同浓度的降钙素原进行检测验证，其中不同降钙素原的浓度配制方式为：首先配置终浓度为1.5pg/ml的proct溶液，逐步稀释以达到检测所需浓度；检测验证结果见图4，从图4(a)中可以明显看出dpv显示的峰值电流随着降钙素原的浓度的增加而明显的降低，图4(b)显示了i/i0在降钙素原浓度从0.15fg/ml到11.7fg/ml之间的数值变化，显示了传感器的检测灵敏度达到0.15fg/ml。

4、将本发明的电化学传感器与现有的传感器的灵敏度分别进行了对比检测，其对比结果见表1。

表1：本发明的电化学传感器与其他传感器灵敏度对比表

5、对本发明的电化学传感器的特异性采用c-反应蛋白进行验证，分别配制电解液空白样本、c-反应蛋白样本、含有降钙素原的c-反应蛋白样本、降钙素原样本，其中纯降钙素原的配制方式为：首先配置终浓度为1.5pg/ml的proct溶液，逐步稀释以达到检测所需浓度，然后利用传感器对上述样本进行检测验证，其检测验证结果见图5，从图5中可以明显看出，与降钙素原样本相比，其余的样本均具有非常弱的峰值电流，显示了本发明的电化学传感器对降钙素原有非常优异的特异选择性。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。