一种检测糖基化CD59的磁性微球检测试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:25315943发布日期:2021-06-04 16:26阅读:来源:国知局

技术特征:
1.一种检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒,由设在盒体内的偶联抗gcd59单克隆抗体的磁微球、gcd59标准品梯度溶液、样品稀释液、过氧化物酶标记的抗cd59单克隆抗体酶结合物、20
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浓缩洗涤液、发光液构成;其特征在于:所述磁微球偶联有浓度为30μg/mg的抗gcd59的鼠单克隆抗体mab1;该磁性微球的工作浓度为0.2mg/ml,稀释液为保存液;所述gcd59标准品梯度溶液分别是:浓度梯度为0pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml的7个标准品溶液,其中0pg/ml为标准品缓冲液;所述样品稀释液的配方是:除菌的1000ml纯水中,含nacl 8g、nah2po4·
2h2o 0.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、sds 0.1g、酪蛋白钠盐5g、tritonx

100 0.1ml、proclin300 1ml;所述过氧化物酶标记的抗cd59单克隆抗体酶结合物是辣根过氧化物酶标记的抗cd59鼠单克隆抗体mab2;该酶标抗cd59鼠单克隆抗体mab2酶结合物工作效价为1:10000,稀释液为酶结合物稀释液;所述20
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浓缩洗涤液的配方是:除菌的50ml双蒸水中,含nacl 8.0g、nah2po4·
2h2o 0.2g、na2hpo4·
12h
2 o 2.9g、吐温20 0.5ml;所述发光液包括a液和b液,浓度为3.0mmol/l的鲁米诺溶液与0.3mmol/l对碘苯酚溶液等体积比的混合液,命名为a液;浓度为7.5mmol/l的双氧水,命名为b液;使用时将a液与b液按体积比1﹕1混合。2.根据权利要求1所述检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒,其特征在于,所述磁微球的制备方法是:1.1)配制偶联缓冲液:即配制0.01mol/l的mes缓冲溶液,并调整ph值为6.0;mes
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1.95g纯化水
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定容至1000ml过滤除菌,4℃保存;1.2)配制洗涤液,洗涤液的配方及制法是:过滤除菌,4℃保存;1.3)配制保存液,保存液的配方及制法是:
过滤除菌,4℃保存;1.4)偶联操作(1)抗体酸化处理酸处理:取1ml 5mg/ml抗体mab1溶液至2.0ml低吸附ep管,向ep管加入0.2ml酸化处理液a,室温40rpm滚轴混匀30min;中和:向酸处理后的抗体溶液中加入0.4ml处理液b中和,缓慢吸打后备用;处理液a:硼酸
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1.06g磷酸二氢钠
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2.34g超纯水
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定容至100ml调ph2.0过滤除菌,4℃保存;处理液b:硼酸
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1.06g磷酸二氢钠
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2.34g超纯水
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定容至100ml调ph9.5过滤除菌,4℃保存;(2)羧基磁性微球的活化:取10mg羧基磁性微球,加入500μl的edc/nhs溶液室温下活化30min,磁分离,偶联缓冲液洗涤磁性微球,得活化后的磁性微球;其中,所述edc是:1

乙基

(3

二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐,所述nhs是:n

羟基丁二酰亚胺,其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制,其浓度均为2mg/ml,使用前将edc与nhs溶液等体积比混匀即得到edc/nhs溶液;(3)羧基磁性微球与mab1抗体偶联:向上述活化后的磁性微球中加入抗gcd59的鼠单克隆抗体mab1,使磁微球偶联mab1抗体的浓度为30μg/mg,室温反应3h,磁分离,洗涤液洗涤,即得免疫磁性微球,加保存液于4℃保存,备用;使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2mg/ml。3.根据权利要求1所述检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒,其特征在于:所述抗gcd59的鼠单克隆抗体mab1和抗cd59鼠单克隆抗体mab2选山东莱博生物科技有限公司产品;其中抗体mab1针对抗原表位的氨基酸序列是:daclitkaglqvynkcwkfehc,抗体mab2针对
抗原表位的氨基酸序列是:lqcyncpnptadcktavncss。4.根据权利要求1所述检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒,其特征在于:所述gcd59标准品梯度溶液的配制方法是:用纯化的重组gcd59蛋白按0pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml的比例,制备模拟血清中gcd59标准品;再配制含5wt%牛血清白蛋白、0.85wt%氯化钠的ph=7.0的1.0mmol/l磷酸氢二钠

磷酸二氢钠的缓冲液获得标准品缓冲液;再以标准品缓冲液制备标准品浓度梯度为0pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml的7个标准品溶液,其中0pg/ml为标准品缓冲液。5.根据权利要求1所述检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒,其特征在于,所述酶结合物稀释液的配方是:除菌的1000ml纯水中,含nacl 8g、nah2po4·
2h2o 0.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、表面活性剂s9 3g、酪蛋白钠盐5g、bsa 10g、proclin300 1ml。6.权利要求1所述检测糖基化cd59的磁性微球检测试剂盒在检测含gcd59生物样品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,检测含gcd59样品的方法是:a)向反应杯中加入样本50μl、磁微粒悬浮液50μl、样品稀释液50μl;b)混匀后37℃温育10分钟;c)用磁性分离架或磁性分离器,清洗液洗涤4次;d)每孔分别加入酶结合物150μl;e)混匀后37℃温育10分钟;f)用磁性分离架或磁性分离器,清洗液洗涤4次;g)每孔加入发光液a液和发光液b液各50μl;h)混匀1~5分钟后检测发光强度;i)以标准品浓度为横坐标,rlu值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,将待测样品的rlu值代入方程式,计算出样品的浓度,得到样品的实际浓度。
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