本发明属于生物技术领域。更具体地,涉及一种金属探针及其基于icp-ms检测cfdna的方法。
背景技术:
细胞外游离核酸(cfdna)是自身免疫性疾病的分子标志物,其对类风湿性关节炎疾病的研究至关重要。cfdna在生物体血浆内的含量非常低(200ug/l),但在类风湿性关节炎病人积液当中浓度会显著增加。目前传统的生物标志物检测方法有:pcr、荧光染料法、荧光光谱法和电化学等方法。传统方法的检出限只能达到mg/l,但实际应用过程中并达不能到检出限级别的准确定量。因此样品常需要富集或者pcr处理才能检出,如中国专利申请cn201910180935.5公开一种血浆cfdna全局性甲基化检测方法,该方法在进行富集甲基化实验后需经过pcr扩增,再进行后续的检测。但是,过多的前处理可能会造成定量结果的偏差。综上,开发和研究更高要求的分析检测手段是cfdna定量方法发展的趋势之一。
因此,亟待于提供一种前处理简单、检测方法简便高效和结果准确的cfdna的分析方法。
技术实现要素:
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足,提供一种金属探针及其基于icp-ms检测cfdna的方法。本发明所述金属探针可以对血浆或积液中提取出来的cfdna特定片段进行检测,结合有较大线性范围的icp-ms检测,实现浓度差距较大的样品同时检测,和对多种待测核酸同时检测,方法简单高效,检测结果准确。
本发明的目的是提供一种金属探针的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种金属探针,所述金属探针中dna-sh端上的-sh与螯合剂连接,螯合剂螯合稀土金属离子;
其中,所述金属探针中dna序列为5'-cggacaaacttcttggcgtaaa-3'。
本发明利用含有稀土金属的化合物标记dna制备金属探针,利用碱基互配和“三明治模型”对特定序列的游离核酸(cfdna)进行标记,其原理简单,操作便捷。标记后的目标序列通过icp-ms对金属的定量,实现间接对cfdna的定量。本发明还可以对多种待测核酸片段进行检测,只要有相应的特征片段,就可以任意组合。
本发明所述金属探针的制备方法,包括以下步骤:
s1-1.将巯基修饰的dna与三(2-氯乙基)磷酸酯反应,还原二硫键,得到dna-sh;
s1-2.加入螯合剂dota反应,得到螯合后的dna-dota溶液;
s1-3.加入稀土金属离子溶液,与螯合后的dna-dota溶液发生螯合反应,得到金属探针;
所述螯合剂dota的结构如式(i)所示:
其中,式(i)所示螯合剂dota是一个双官能团的螯合物,稀土金属在多元环内可形成稳定络合物,另一端的马来酰亚胺可与巯基修饰后的dna发生反应。
优选地,步骤s1-3.中,所述稀土金属为铽、镧、铈或钆。
更优选地,步骤s1-3.中,所述稀土金属为铽。
优选地,步骤s1-2.中,所述螯合剂dota与dna-sh的摩尔比为10~20:1。
更优选地,步骤s1-2.中,所述螯合剂dota与dna-sh的摩尔比为20:1。
优选地,步骤s1-3.中,所述稀土金属与巯基修饰的dna的摩尔比为30~40:1。
更优选地,步骤s1-3.中,所述稀土金属与巯基修饰的dna的摩尔比为40:1。
优选地,对制备得到的金属探针经进一步纯化,所述纯化方法是利用高效液相色谱过柱进行洗脱,洗脱后得到的产物冻干。
本发明同时还保护所述金属探针或所述制备方法在检测cfdna含量中的应用。
一种cfdna含量的检测方法,包括以下步骤:
s2-1.加入待测cfdna、金属探针和捕获探针,进行杂交反应,得到“三明治模型”;
s2-2.将“三明治模型”加入到有链亲霉素包被的96孔板中,固定cfdna,洗涤;
s2-3.加入硝酸,80~90℃下加热反应后,定容,icp-ms检测,根据标准曲线测定cfdna含量;
其中,所述捕获探针中dna序列为5'-ttatgtgtctgccactggtgc-3'。
电感耦合等离子体质谱(icp-ms)作为一种痕量多元素分析手段,通过元素标记策略对生物大分子进行检测可以充分利用icp-ms的优势,将生物体中不存在以及对icp-ms检测没有干扰、灵敏度高的元素标记在生物大分子上,并通过icp-ms对标记的元素进行检测,从而实现对生物大分子的定性和定量分析。该方法具有以下优点:(1)元素标记不需要探针具有光学、电化学等特性,标记的元素可通过icp-ms直接检测;(2)生物体稀土元素内含量低,基体效应小,干扰因素少;(3)icp-ms检出限低,灵敏度高;(4)针对不同片段dna实现多元素标记。
本发明利用dna的碱基互配,金属探针与目标dna(cfdna)、生物素标记的捕获探针按照“三明治模型”进行杂交反应。利用链亲霉素对杂交反应后的产物进行捕获,通过生物素与链亲霉素反应,实现cfdna的固定,洗去多余的金属探针,用硝酸消解的方式将稀土金属离子释放出来,通过icp-ms对稀土金属离子进行定量分析,再用稀土金属离子定量dna。本发明将icp-ms分析方法和cfdna检测通过金属探针联系在一起,可以准确定量特定序列核酸浓度。此外,本发明不需要对样品进行过多处理,一般情况下不需要核酸扩增即可检测,从采样到检测的用时较短;且本发明无需通过pcr扩增手段对样品中的特定序列的游离核酸进行定量,减少了pcr扩增所带来的如非特异扩增、得不到扩增产物等因素影响。
优选地,所述捕获探针的3’端具有生物素标记。
优选地,步骤s2-3.中,所述标准曲线中,标准品溶液的浓度范围为0.1-5.0pmol。
本发明同时还保护所述检测方法在cfdna定量检测中的应用。
本发明所述检测方法还可用于液体活检,对比传统的组织活检存在创伤性和取材限制,液体活检在体液中检测生物标志物分子的技术方法作为临床检验新技术正逐步推广应用,本发明作为一种便捷、非侵入性的cfdna检测方法,可实现多次取材,为开发可靠的、可重复的液体活检检测提供了新的方法。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种金属探针及其基于icp-ms检测cfdna的方法。本发明利用含有稀土金属的化合物标记dna制备金属探针,通过icp-ms对金属探针上金属定量,间接定量cfdna。本发明可以对血浆或积液中提取出来的cfdna特定片段进行检测,结合有较大线性范围的icp-ms检测,实现浓度差距较大的样品同时检测,和对多种待测核酸同时检测,且检出限在现有方法的基础上大大降低,可以准确定量cfdna到ng/l级别,方法简单高效,检测结果更加准确。
附图说明
图1为dna-sh的lc-ms图;
图2为dota-mma-dna的lc-ms图;
图3为金属探针的lc-ms图;
图4为本发明金属探针纯化后的色谱图;
图5为本发明金属探针纯化后的lc-ms图;
图6为本发明“三明治模型”图;
图7为目标cfdna与tb浓度的关系图;
图8为“三明治模型”的有效性验证结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实验所用核酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1金属探针的合成
1.溶液制备:
(1)将5.3mg(10mmol)dota-mma(cas:1006711-90-5)溶于2mlnh4oac缓冲液(ph6.5)中,配置5m的dota-mma储备液以待使用。
(2)将5.3mg(20mmol)tbcl3溶于2mlnh4oac缓冲液(ph6.5)中,配置10m的tbcl3的储备液以待使用。
(3)将3mg(6mmol)三(2-氯乙基)磷酸酯(tcep)溶于2mlnh4oac缓冲液(ph6.5)中,配置3mtcep的储备液以待使用。
2.金属探针的制备:
(1)样品二硫键的还原:在2ml样品管中加入500μl巯基修饰的dna(100um),再加入1mltcep储备液后在37℃下反应1小时,得,dna-sh(化合物a),其检测结果如图1所示。
(2)马来酰亚胺与dna巯基的反应:在上述样品管中加入200μldota-mma储备液,60℃下反应1小时。得到dota-mma-dna(化合物b),其检测结果如图2所示。
(3)环内鳌合金属tb反应:在同一个样品管中加入200μltbcl3储备液(40倍过量,2umol),25℃下反应12小时或以上。得到金属探针,其检测结果如图3所示。
(4)制备得到金属探针,因为产物里存在过量的tb、dota-mma或dota-mma-tb。因此需要对产物进行纯化。纯化方法是利用高效液相色谱过柱进行洗脱,洗脱后得到的产物冻干,配成100um的储备液,检测结果如图4、图5所示。
其中,高效液相色谱条件为:uv=260nm,thermohypersilgold,150×4.6mm,5um,0.8ml/min的流动速率。流动相a为0.01%甲酸溶液,调ph值到4.0,流动相b为甲醇;其中,0-2分钟,95%流动相a;2-7分钟,95-70%流动相a;7-9分钟,70-1%流动相a;9-10分钟,1%-95%流动相a。
结果显示,图1为dna原料的分子量,证明二硫键被还原;图2质谱结果是dna-dota的分子量,证明得到的产物为dna-dota;图3为dna-dota-tb的分子量,证明得到的产物为金属探针。图4为金属探针的纯化图;图5是对金属探针的纯化后得到两个峰的产物进行质谱分析,得到第一个峰的产物分子量就是金属探针的分子量,表明第一个峰的产物是金属探针。
实施例2性能测试实验
1.三明治模型
利用dna的碱基互配原理,将金属探针与目标dna(cfdna)、生物素标记的捕获探针按照三明治模型进行杂交反应。然后,通过链亲霉素包被的孔板对杂交产物进行捕获(生物素与链亲霉素反应),实现目标cfdna的固定,洗去多余的金属探针,用硝酸消解的方式将金属铽(tb)释放出来,再用icp-ms定量tb,再用tb定量dna。具体过程如图6所示。
2.金属探针、捕获探针、目标cfdna的碱基序列设计与修饰
表1各段dna序列及其修饰
3.icp-ms检测步骤
(1)首先在200μlpcr管中加入0、0.5、1、2、5pmol的目标cfdna,再依次加入15pmol的金属探针和10pmol的捕获探针,最后加入缓冲液a10×pbs,0.1%吐温20(tween20))使得最终体积为60μl。每个样品分别做八个平行样品。将所有pcr管放入pcr仪中使其中的样品进行碱基互配(升温程序为0-3min,93℃;3-13min,50℃;13-43min,37℃;43-73min,25℃)。
(2)将反应后的产物转移至链亲霉素包被的孔板中,在孔板内孵育1小时,使生物素与链亲霉素充分反应。结束反应后,用缓冲液b(10×pbs,0.1%tween20,0.1%bsa)洗板五次,buffera洗板5次,洗去未反应的金属探针。
(3)孔板中加入300μl50%(v/v)hno3,90℃下加热1小时,将金属释放出来。最后将产物转移至2ml的样品管中,产物用5%(v/v)的hno3定容至1ml。
(4)采用bi为内标(化学性质与tb相近且样品溶液中不含bi),用icp-ms检测样品中所含tb的量,得到标准曲线。结果如图7所示。
其中,icp-ms检测条件为:
4.方法的有效性性验证
在1pmol的目标cfdna和非目标cfdna中分别加入过量金属探针和捕获探针,按照icp-ms检测步骤重复试验,得到结果如图8所示。
其中,目标dna序列:
gcaccagtggcagacacataattacgccaagaagtttgtccg;
非目标dna的序列:
gcaccagtggcaatcacataattacgccaagaagtttgtccg(seqidno.5)。
由图8结果可知,该方法具有特异性差异,具有特异性识别cfdna的作用,在实际样品中可以排除干扰。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120>一种基于元素标记-电感耦合等离子体质谱检测策略的cfdna分析方法及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>1
cggacaaacttcttggcgtaaa22
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
ttatgtgtctgccactggtgc21
<210>3
<211>42
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>3
gcaccagtggcagacacataattacgccaagaagtttgtccg42
<210>4
<211>400
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>4
agagcaagactccatctcaaaaaaaaaaaaaaagtttataaatttgtgttgggcctcatt60
caaagctgcactgggccacaggtcggacaaacttggcgtaaaatatttttgggttgtcac120
aattaactaacggggaggttgctgctggcctccagtcggtggaggccaaggatgctgcta180
agcatcctgcaatgcacaggaaacaaccaattaaccccacagtgaagaattatccagccc240
ccaatcccagtgaccaagactgaaaaacccgggctgggagagacagtgctgccatcgatt300
gcttatgtctgccactggtgcagacagggtggtggtgatgcctgcaatcctaatcccacc360
cggcagactgtcctgaatgtataacccatctcacctccca400
<210>5
<211>42
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>5
gcaccagtggcaatcacataattacgccaagaagtttgtccg42