一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法与流程

1.本发明涉及物质检测技术领域，尤其涉及一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法。


背景技术：

2.单宁酸又名鞣酸，别名丹宁、丹宁酸、没食子鞣酸、鞣质等。因具有抗氧化和收敛性已被人们广泛认识。单宁作为红葡萄酒的骨架，能在感官上带苦味和涩味，同时也影响着红酒的风味和质地，也可稳定红葡萄酒的色素，使其保持鲜活的颜色，也能使酒体更加坚实饱满并具余味持久。单宁欠缺的葡萄酒往往显得瘦弱寡淡，风味不足。
3.研究报道的单宁的定量检测方法很多，经典的有皮粉法、干酪素法、氧化滴定法和分光光度法；现阶段涌现出许多新型的测定方法，如高效液相色谱法、流动注射分析法，但在实际中还是以分光光度法为主。
4.对于水果、蔬菜及葡萄酒，现行推广的行业标准《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定》(ny/t1600
‑
2008)属于分光光度法，该法主要测定的是提取物中以没食子酸为主的单宁类化合物的总量，而非单宁酸的含量。随之出现的高效液相色谱法，因具有分离效能高、分析速度快、样品用量少等优点，目前也被用于检测样品中单宁酸的含量，已报道的检测样品有五倍子、核桃渣、余甘子、烟叶、星油藤等，但是前处理过程存在提取步骤繁琐等缺点。且，对于酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸含量的测定目前暂没有相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法，本发明提供的检测方法提取步骤简单，且能够快速高效实现对酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法，包括以下步骤：
8.将待测样品和提取剂混合，进行提取，得到待测溶液；
9.对所述待测溶液进行高效液相色谱
‑
紫外检测，得到所述待测样品中单宁酸的含量；
10.所述提取剂为甲醇水溶液；
11.所述提取在振荡的条件下进行，所述振荡的调速为180～220r/min，时间为20～60min；
12.所述待测样品包括待测酿酒葡萄或待测葡萄酒。
13.优选地，所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比为(3～9)：1。
14.优选地，当所述待测样品为待测酿酒葡萄时，所述待测酿酒葡萄和提取剂的用量比为(2.00～10.00)g：(15～50)ml。
15.优选地，当所述待测样品为待测葡萄酒时，所述待测葡萄酒和提取剂的体积比为
(2.00～10.00)：(15～50)。
16.优选地，所述提取后，还包括将所得提取体系进行离心分离，取上清液作为待测溶液。
17.优选地，所述高效液相色谱
‑
紫外检测的参数包括：
18.色谱柱：ultimateaq
‑
c18柱，4.6
×
250mm，5μm；
19.流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为乙腈，流动相b为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液；
20.流速；0.8ml/min；
21.柱温：25℃；
22.进样体积：10μl；
23.洗脱方式：梯度洗脱；
24.所述梯度洗脱的程序为：
25.0～15min：5～8％流动相a；
26.15～20min：8～10％流动相a；
27.20～20.1min：10～80％流动相a；
28.20.1～25min：80～5％流动相a；
29.25～30min：5％流动相a；
30.检测波长：280nm。
31.优选地，所述高效液相色谱
‑
紫外检测后，还包括将得到的单宁酸的峰面积代入到单宁酸标准样品的浓度
‑
峰面积标准曲线中，得到所述待测样品中单宁酸的含量。
32.本发明提供了一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法，包括以下步骤：将待测样品和提取剂混合，进行提取，得到待测溶液；对所述待测溶液进行高效液相色谱
‑
紫外检测，得到所述待测样品中单宁酸的含量；所述提取剂为甲醇水溶液；所述提取在振荡的条件下进行，所述振荡的调速为180～220r/min，时间为20～60min；所述待测样品包括待测酿酒葡萄或待测葡萄酒。本发明以甲醇水溶液作为提取剂，在振荡的条件下，高效、快速地将单宁酸从待测酿酒葡萄或待测葡萄酒中提取出来；再结合高效液相色谱
‑
紫外检测技术，可快速、准确地测定待测样品中单宁酸的含量，填补了酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸含量检测分析方法的空白。进一步地，本发明的前处理方法操作简单、安全可靠、成本低、耗时少，可以实现大批量样品同时进行提取，大大提高了检测效率；此外，流动相梯度洗脱程序中，大大减少了有机试剂乙腈的消耗，节省了试验成本。实施例的数据表明：本发明提供的检测方法精密度好、稳定性好、回收率好。
附图说明
33.图1为单宁酸标准样品(浓度为0.5～100mg/l)的浓度
‑
峰面积标准曲线图；
34.图2为浓度为5.0mg/l的单宁酸标准样品溶液的液相色谱图；
35.图3为市售酿酒葡萄中单宁酸的液相色谱图；
36.图4为市售葡萄酒中单宁酸的液相色谱图。
具体实施方式
37.本发明提供了一种酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法，包括以下步骤：
38.将待测样品和提取剂混合，进行提取，得到待测溶液；
39.对所述待测溶液进行高效液相色谱
‑
紫外检测，得到所述待测样品中单宁酸的含量。
40.在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
41.本发明将待测样品和提取剂混合，进行提取，得到待测溶液。
42.在本发明中，所述待测样品优选待测酿酒葡萄或待测葡萄酒；所述待测样品为待测酿酒葡萄时，所述待测酿酒葡萄在与提取剂混合前，优选进行破碎，本发明对所述破碎的操作不做具体限定，只要能够将酿酒葡萄整颗打碎即可；在本发明的具体实施例中，所述待测样品优选为待测酿酒葡萄时，优选采用破壁机将所述待测酿酒葡萄打碎。
43.在本发明中，所述提取剂为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液中甲醇和水的体积比优选为(3～9)：1，进一步优选为9：1。在本发明中，当待测样品优选为待测酿酒葡萄时，所述待测酿酒葡萄和提取剂的用量比优选为(2.00～10.00)g：(15～50)ml，进一步优选为3.00g：25.0ml。在本发明中，当待测样品优选为待测葡萄酒时，所述待测葡萄酒和提取剂的体积比优选为(2.00～10.00)：(15～50)，进一步优选为3.00：25。
44.在本发明中，所述提取在振荡的条件下进行，所述振荡的调速为180～220r/min，优选为200r/min，所述振荡的时间为20～60min，优选为20min。
45.所述提取后，本发明优选还包括将所得提取体系进行离心分离，取上清液作为待测溶液。
46.本发明对所述离心分离的转速和时间不做具体限定，只要能够实现固液分离，得到澄清上清液即可，在本发明的具体实施例中，所述离心分离的转速优选为4000r/min，时间优选为3min。
47.得到待测溶液后，本发明对所述待测溶液进行高效液相色谱
‑
紫外检测，得到所述待测样品中单宁酸的含量。
48.在本发明中，所述高效液相色谱
‑
紫外检测的参数优选包括：
49.色谱柱：ultimateaq
‑
c18柱，4.6
×
250mm，5μm；
50.流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为乙腈，流动相b为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液；
51.流速；0.8ml/min；
52.柱温：25℃；
53.进样体积：10μl；
54.洗脱方式：梯度洗脱；
55.所述梯度洗脱的程序如表1所示。
56.表1梯度洗脱的程序
[0057][0058]
检测波长：280nm。
[0059]
所述高效液相色谱
‑
紫外检测后，本发明优选还包括将得到的单宁酸的峰面积代入到单宁酸的浓度
‑
峰面积标准曲线中，得到所述待测样品中单宁酸的含量。
[0060]
本发明对所述单宁酸的浓度
‑
峰面积标准曲线的获取方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的标准曲线的获取方式即可。
[0061]
下面结合实施例对本发明提供的酿酒葡萄及葡萄酒中单宁酸的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0062]
以下实施例中所用的高效液相色谱
‑
紫外检测的参数包括：
[0063]
色谱柱：ultimateaq
‑
c18柱(4.6
×
250mm，5μm)；流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a为乙腈，流动相b为体积浓度为0.1％的磷酸水溶液；梯度洗脱程序如表1所示；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样体积：10μl。
[0064]
标准曲线的建立
[0065]
称取0.01011g(精确到0.0001g)单宁酸固体粉末于棕色小瓶中，用刻度吸管移入10.00ml甲醇，涡旋溶解，配制成1000mg/l标准贮备溶液。
[0066]
依次稀释配制成0.5、2、10、20、40、60、80、100mg/l单宁酸标准溶液进样，利用上述高效液相色谱
‑
紫外检测的参数进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制单宁酸标准样品的浓度
‑
峰面积标准曲线图，如图1所示，所得单宁酸标准样品的浓度
‑
峰面积标准曲线为：y＝2736.9x
‑
1931.8，r2＝0.9997，r为0.9998，检测方法的定量限为0.5mg/l，检出限为0.3mg/l。
[0067]
图2为浓度为5.0mg/l的单宁酸标准样品溶液的液相色谱图；从图2可以看出：单宁酸的峰型尖锐且对称，其保留时间为11.91min左右。
[0068]
待测样品的前处理：称取酿酒葡萄样品(来源为市售赤霞珠酿酒葡萄)3.00g、葡萄酒样品(来源为市售赤霞珠干红葡萄酒)3.00ml分别于50ml离心管中，加入25.0ml甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为9：1)，在调速为200r/min的条件下振荡20min后，于4000r/min离心分离3min，吸取上清液过膜装进样小瓶，得到待测溶液；利用上述高效液相色谱
‑
紫外检测的参数进行检测，所得酿酒葡萄和葡萄酒中单宁酸的液相色谱图如图3和4所示。从图3和4中可以看出：目标峰保留时间处无杂峰干扰，表明本发明提供的检测方法特异性良好。
[0069]
重复性试验
[0070]
在酿酒葡萄中分别添加0.5、5.0、20mg/kg的单宁酸标准样品，测定回收率，结果如表2所示。
[0071]
表2酿酒葡萄中单宁酸添加回收(n＝5)
[0072][0073]
从表2可以看出：在0.5、5.0、20mg/kg 3个浓度添加水平，酿酒葡萄中单宁酸的平均回收率在86％～99％之间，相对标准偏差在0.7％～6.0％之间，均满足检测方法的要求。
[0074]
在葡萄酒中分别添加在5.0、20、40mg/kg的单宁酸标准样品，测定回收率，结果如表3所示。
[0075]
表3葡萄酒中单宁酸添加回收(n＝5)
[0076][0077]
从表3可以看出：在5.0、20、40mg/kg 3个浓度添加水平，葡萄酒中单宁酸的平均回收率在81％～92％之间，相对标准偏差在1.3％～4.8％之间，均满足检测方法的要求。
[0078]
精密度试验
[0079]
将质量浓度为5.0mg/l单宁酸标准样品溶液，连续进样7次，记录峰面积，计算单宁酸标准品峰面积rsd值，结果如表4。
[0080]
表4精密度试验结果
[0081]
进样次数1234567平均rsd％峰面积12754127321274912727127811279312835127670.3
[0082]
从表4可以看出：以质量浓度为5.0mg/l单宁酸标准样品溶液连续进样7次，得出单宁酸标准样品峰面积rsd值为0.3％，说明精密度良好，满足检测方法的要求。
[0083]
稳定性试验
[0084]
取同一酿酒葡萄样品提取液，将样品在室温分别放置0、2、5、8、12、16、20、24h后，通过高效液相色谱仪进行分析，记录峰面积，计算样品中单宁酸峰面积rsd值，结果如表5所示。
[0085]
表5稳定性试验结果
[0086]
放置时间/h025812162024rsd％峰面积19553193442095720062202992035420605200432.6
[0087]
从表5可以看出：同一酿酒葡萄样品提取液，分别放置0、2、5、8、12、16、20、24h后，其峰面积rsd为2.6，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0088]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。