同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒与流程

同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2021年05月14日提交中国专利局的申请号为cn202110526613.9、名称为“同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
3.本发明涉及化学分析和检测技术领域，具体而言，涉及同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒。


背景技术：

4.维生素是维持人体正常生理功能、维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质。其在体内需求量较少，主要由食物供给，并在调节物质代谢过程中发挥重要作用。
5.目前，已知人体内含有多种维生素，根据其极性大小可分为脂溶性和水溶性维生素两大类。水溶性维生素包括b族维生素和维生素c，其中b族维生素是对在功能、结构、理化特性上相似的一类维生素的统称，其结构中全部含有氮，均易溶于水，主要以辅酶的形式参与体内多种物质的合成和分解代谢过程，与血细胞的形成及能量的释放有着密切关系。b族维生素缺乏与多种疾病的发生发展密切相关，可导致皮肤病，记忆衰退，乏力失眠，精神衰弱等。如vb1缺乏病俗称脚气病，vb2缺乏症又被称为＂口腔生殖系统综合征＂，vb6缺乏可导致脂溢性皮炎，vb9缺乏可引起高同型半胱氨酸血症，胎儿神经管畸形，vc缺乏可引起坏血症，人体抵抗力下降等。因此，监测人体内水溶性维生素的含量，有助于评价人体营养状况、监测疾病的诊断和治疗过程，具有非常重要的临床意义。
6.临床检测人体内水溶性维生素的方法主要有免疫分析法，液相色谱法及液相色谱串联质谱法等。免疫测定法是利用免疫学原理，以待测物作为抗原或抗体从而测定样品中待测物质含量的方法，通常操作简便，无复杂样本预处理步骤，但是不具备待测物特异性分析与高通量检测；液相色谱法是通过分析物与流动相和固定相之间的相互作用实现分离并检测，与免疫分析法相比，具有更好的分离能力及分析特异性；液相色谱
‑
串联质谱(lc
‑
ms/ms)法则结合了色谱分离特性和质谱的定性功能，对复杂混合物的定量分析更为准精准，并能实现高通量一次性测试检测多维生素，但是即使采用液相色谱
‑
串联质谱检测维生素依然存在时间长和检测效果不够准确等问题。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供同时检测多种维生素的方法和检测试剂盒。本发明实施例提供一张新的多种维生素的检测方法，其检测速度快，基本可以在5分钟内实现15种维生素的检测，且检测结果准确。
9.本发明是这样实现的：
10.第一方面，本发明提供一种同时检测多种维生素的方法，包括：利用萃取液对血液样本进行预处理，而后，将待测维生素的同位素内标混合液与预处理后的所述血液样本混合，接着，采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，所述萃取液包括质量百分数为1
‑
10％的tca的醇水溶液。
11.第二方面，本发明提供一种用于同时检测多种维生素的检测试剂盒，其包括前述实施方式所述的同时检测多种维生素的方法所需要的萃取液包、待测维生素的内标混合溶液包以及液相色谱所用的流动相溶剂包。
12.本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过采用1
‑
10％的tca的醇水溶液对血液样本进行预处理，能够有效对血液样本中的多种维生素进行萃取，继而提升多种维生素的检测效果，同时，缩短检测时间。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为本发明检验例1提供的洗脱梯度1的结果图；
15.图2为本发明检验例1提供的洗脱梯度2的结果图；
16.图3为本发明检验例2提供的流动相1的结果图；
17.图4为本发明检验例2提供的流动相2的结果图；
18.图5为本发明检验例2提供的流动相3的结果图；
19.图6为本发明检验例3提供的检测结果图；
20.图7为本发明检验例4提供的检测结果图；
21.图8为本发明检验例5提供的b1与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
22.图9为本发明检验例5提供的b2与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
23.图10为本发明检验例5提供的b3与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
24.图11为本发明检验例5提供的b3
‑
nh2与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
25.图12为本发明检验例5提供的b5与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
26.图13为本发明检验例5提供的b6
‑
oh与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
27.图14为本发明检验例5提供的b6
‑
cooh与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
28.图15为本发明检验例5提供的b6
‑
cho与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
29.图16为本发明检验例5提供的b6
‑
nh2与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
30.图17为本发明检验例5提供的b7与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
31.图18为本发明检验例5提供的b9与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
32.图19为本发明检验例5提供的5
‑
mthf与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
33.图20为本发明检验例5提供的b12与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
34.图21为本发明检验例5提供的vc与内标对比色谱图及标准曲线线性图；
35.图22为本发明检验例5提供的b13与内标对比色谱图及标准曲线线性图。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.本发明实施例提供一种同时检测多种维生素的方法，包括：
38.利用萃取液对血液样本进行预处理，使得血液样本中的蛋白质沉淀，其中，采用的萃取液包括质量百分数为1
‑
10％的tca的醇水溶液，此处的意思是在醇水溶液中tca的质量含量为1
‑
10％。采用该萃取液能够保证蛋白质的沉淀效果，继而有利于提升各个维生素的萃取效果，继而提升检测的准确性。若更改此萃取液，例如改为纯醇溶剂或者醇
‑
乙腈溶剂都对导致维生素的萃取效果降低，继而影响检测效果的准确性。
39.进一步地，醇水溶液为为一元醇和水的混溶溶液，且其为体积百分数为35
‑
75％的醇溶液；即该醇水溶液中醇的体积含量为35
‑
75％，优选为50％，且该一元醇包括甲醇，但是也可以采用乙醇等一元醇。
40.进一步地，所述萃取液与所述血液样本的体积比为1:1
‑
4:1，且血液样本包括血浆样本或者血清样本，该样本可以为人血样本，也可以是动物血样本。
41.而后，将待测维生素的同位素内标混合液与预处理后的所述血液样本混合，其中，同位素内标混合液为对应待测维生素的同位素内标溶液，例如，多种所述维生素为水溶性维生素，且包括b1、b2、b3、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
oh、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b6
‑
nh2、b7、b9、5
‑
mthf、b12、vc和b13中的至少9种，那么对应的同位素内标混合液为待测的上述9种、10种、11种、12种、13种、14种或者15种等情况对应的维生素的同位素内标混合溶液。其中，待测多种维生素标准品和对应同位素内标信息如下表：
42.[0043][0044]
需要说明的是，供应商可以采用其他供应商，此处仅仅是举例，并不是必须仅能为该供应商提供的维生素纯品。
[0045]
接着，采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，液相色谱的条件包括：色谱柱：agela venusil mp c18(3μm,3.0x30 mm)，流动相a：2
‑
10mm的乙酸铵水溶液；流动相b：2
‑
10mm的乙酸铵醇溶(例如为乙酸铵和甲醇的混合溶液，且乙酸铵在该混合溶液的浓度为2
‑
10mm)液，且所述乙酸铵醇溶液中含有体积百分数为0.05
‑
0.15％的甲酸；洗脱条件包括：0.0
‑
0.5min，99％a，0.5
‑
2.6min，10％a，2.6
‑
3.6min，1％a，3.6
‑
4.5min，99％a；流速0.3
‑
0.4ml/min；进样量为2
‑
10μl。采用上述流动相以及洗脱过程有利于各维生素的分离，提升检测结果的准确性，也有利于缩短检测时间。
[0046]
进一步地，质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测，具体地，气帘气：
20.0kpa，离子源温度：150℃，去溶剂温度：550℃，去溶剂气流速：800l/hr，喷雾电压：5.5kv，锥孔电压：30v，锥孔气流：30l/hr。其中，各个维生素的mrm质谱参数见表1：
[0047]
表1
[0048][0049]
具体地检测过程：将与同位素内标混合液混合待测样品注入液相色谱仪，经色谱分离后，导入质谱仪，在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下，聚焦进入三重四级杆质量分析器。在第一级四级杆(q1)中，带电离子按质荷比分离，筛选出母离子，随后进入第二极四级杆(q2)中，在碰撞气体和碰撞能量的作用下，碎裂形成碎片离子，产生的碎片离子进入到第三极四级杆(q3)，按质荷比分离，筛选出目标子离子，最终进入检测器，产生信号得到检测结果。而后将该检测结果带入校准曲线和线性回归方程，中进而计算出待测样本中多种水溶性维生素的测定值。其中，校准品曲线以及线性回归方程的获得与现有技
术内标法检测的操作相同，此处不再进行详述。
[0050]
进一步地，本发明实施例还提供一种用于同时检测多种维生素的检测试剂盒，其包括能够实施上述同时检测多种维生素的方法的萃取液包、待测维生素的内标混合溶液包以及液相色谱所用的流动相溶剂包，其中，萃取液包、待测维生素的内标混合溶液包以及液相色谱所用的流动相溶剂包的成分以及含量等均与上述方法中使用的对应物质的成分和含量一致。
[0051]
其还包括待测维生素的校准品混合液包和待测维生素的多水平质控品混合液包，同理，该校准品混合液包和多水平质控品混合液包中维生素的组合与待测的维生素的组合相同。
[0052]
进一步地，其还包括稀释液包；所述稀释液包中包括：pbs。
[0053]
进一步地，上述待测维生素的内标混合溶液包、待测维生素的校准品混合液包和待测维生素的多水平质控品混合液还包括有能够保护水溶性维生素的保护试剂，例如可以包括2到10mg/ml的柠檬酸，当然可以理解的是，也可以采用其他保护试剂，例如，dtt。
[0054]
需要说明的是，上述试剂盒中的“包”仅仅表示对应的溶液或者物质单独放置，并不一定代表对应的溶液或者物质为袋装，也可以为瓶装或者其他单独的包装。
[0055]
例如，该试剂盒的成分等如表2所示：
[0056]
表2
[0057]
[0058][0059]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0060]
实施例1
[0061]
本实施例提供一种同时检测多种维生素的方法，包括：
[0062]
仪器：串联质谱系统：ab sciex jasper hplc
‑
ab4500质谱；涡旋振荡器、低温高速离心机、移液器及枪头，样本准备ep管，96
‑
孔进样板及板垫。
[0063]
标准品：b1：约25ng/ml；b2：约100ng/ml；b3：约200ng/ml；b3
‑
nh2：约100ng/ml；b5：约250ng/ml；b6
‑
oh：约25ng/ml；b6
‑
cooh：约50ng/ml；b6
‑
cho：约200ng/ml；b6
‑
nh2：约50ng/ml；b7：约50ng/ml；b9：约100ng/ml；5
‑
mthf：约100ng/ml；b12：约50ng/ml；vc：约50μg/ml；b13：约100ng/ml；
[0064]
质控品
‑
1：b1：约18.75ng/ml；b2：约75ng/ml；b3：约150ng/ml；b3
‑
nh2：约75ng/ml；b5：约187.5ng/ml；b6
‑
oh：约18.75ng/ml；b6
‑
cooh：约37.5ng/ml；b6
‑
cho：约150ng/ml；b6
‑
nh2：约37.5ng/ml；b7：约37.5ng/ml；b9：约75ng/ml；5
‑
mthf：约75ng/ml；b12：约37.5ng/ml；vc：约37.5μg/ml；b13：约75ng/ml；
[0065]
质控品
‑
2：b1：约1.5ng/ml；b2：约6ng/ml；b3：约12ng/ml；b3
‑
nh2：约6ng/ml；b5：约15ng/ml；b6
‑
oh：约1.5ng/ml；b6
‑
cooh：约3ng/ml；b6
‑
cho：约12ng/ml；b6
‑
nh2：约3ng/ml；b7：约3ng/ml；b9：约6ng/ml；5
‑
mthf：约6ng/ml；b12：约3ng/ml；vc：约3μg/ml；b13：约6ng/ml；
[0066]
及其同位素内标。
[0067]
获得标准品曲线：以校准样品的浓度为自变量x
i
，以相应外标和内标的峰面积比值为因变量y
i
，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r，r应≥0.99。
[0068]
质控样品数据分析：当校准曲线的r≥0.990时，将质控品的信号强度带入回归方程，获得质控样品浓度；
[0069]
样本数据分析：当质控品的测定结果在允许范围内时，萃取实际临床样本中的多种水溶性维生素，进行lc
‑
ms/ms测定，获得其的测定值，通过校准曲线线性回归方程，计算临床样本中多种水溶性维生素的浓度；
[0070]
液相色谱的条件：色谱柱：agela venusil mp c18(3μm,3.0x30 mm)，流动相a：5mm的乙酸铵水溶液；流动相b：5mm的乙酸铵
‑
甲醇溶液，且所述乙酸铵
‑
甲醇溶液中含有体积百分数为0.10％的甲酸；洗脱条件包括：0.0
‑
0.5min，99％a，0.5
‑
2.6min，10％a，2.6
‑
3.6min，1％a，3.6
‑
4.5min，99％a；流速0.4ml/min；进样量为2
‑
10μl。
[0071]
质谱条件：气帘气：20.0kpa，离子源温度：150℃，去溶剂温度：550℃，去溶剂气流速：800l/hr，喷雾电压：5.5kv，锥孔电压：30v，锥孔气流：30l/hr。其中，各个维生素的mrm质谱参数见表1。
[0072]
检测样本制备：取混合水溶性维生素校准品，以pbs缓冲液为稀释液进行梯度稀释，制备校准曲线工作溶液c1
‑
c6(表3)；取校准曲线工作液c1
‑
c6，试剂盒中所含质控样本qc
‑
1、qc
‑
2或临床血清样本各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul萃取液，所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0073]
表3
[0074]
分析物c6c5c4c3c2c1b1(ng/ml)0.512.5512.525b2(ng/ml)24102050100b3(ng/ml)482040100200b3
‑
nh2(ng/ml)24102050100b5(ng/ml)5102550125250b6
‑
oh(ng/ml)0.512.5512.525b6
‑
cooh(ng/ml)125102550b6
‑
cho(ng/ml)482040100200b6
‑
nh2(ng/ml)125102550b7(ng/ml)125102550b9(ng/ml)241020501005
‑
mthf(ng/ml)24102050100b12(ng/ml)125102550vc(μg/ml)125102550b13(ng/ml)24102050100
[0075]
样本检测：将封紧的96孔u型板置于液相色谱串联质谱仪中，设置2
‑
10μl进样量，进行检测，而后将结果带入回归方程进行计算，得到结果。
[0076]
待测血清样本本来自北京豪思生物科技检验所，且待测血清样本有79例，79例均按照上述方法进行检测，检测结果如下表：
[0077]
[0078]
[0079]
[0080][0081]
[0082]
检验例1
[0083]
评估使用不同梯度洗脱参数设置对本发明实施例提供的检测方法的影响
[0084]
1)制备待测样本：取水溶性维生素混合溶液，含：b1、b2、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b7、b9和5
‑
mthf，浓度分别为50ng/ml；
[0085]
2)配制待测样本：取待测样本100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul萃取液，萃取液10％tca甲醇水混合溶液。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0086]
3)设置洗脱梯度1：0.0
‑
0.5min，99％a，0.5
‑
2.6min，10％a，2.6
‑
3.6min，1％a，3.6
‑
4.5min，99％a；流速0.4ml/min；
[0087]
4)设置洗脱梯度2：0.0
‑
0.5min，99％a，0.5
‑
3.0min，10％a，3.0
‑
4.0min，99％a；流速0.3ml/min
[0088]
5)样本检测：将封紧的96孔u型板置于液相色谱串联质谱仪中，设置2
‑
10μl进样量，进行检测。
[0089]
检测结果参见图1和图2，其中图1为洗脱梯度1的结果；图2为洗脱梯度2的结果，根据此结果可知，在使用洗脱梯度2时，水溶性维生素的总体的保留、分离程度及灵敏度较洗脱梯度1差，其中b6
‑
cho,b6
‑
cooh和b7几乎无保留，在保留的几个待测物中，b1,b5,b9和5
‑
mthf灵敏度跟洗脱梯度1的结果比起来有大幅度下降，说明采用本发明实施例的洗脱方式才能有效保证分离效果，继而保证检测准确性。
[0090]
检验例2
[0091]
评估使用不同洗脱相对本发明实施例提供的检测方法的影响
[0092]
1)制备待测样本：取水溶性维生素混合溶液，含：b1、b2、b3、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
oh、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b6
‑
nh2、b7、b9、5
‑
mthf、b12、vc和b13，浓度分别为50ng/ml；
[0093]
2)配制待测样本：取待测样本100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul萃取液，萃取液10％tca甲醇水混合溶液。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0094]
3)配制流动相1：取纯净水500ml，加入192mg乙酸铵(分析级)，超声脱气，备用；取甲醇(分析级)500ml，加入500ul甲酸+192mg乙酸铵，超声脱气，即流动相a为5mm乙酸铵水溶液，流动相b为5mm乙酸铵甲醇溶液，含0.10％体积比的甲酸；备用；
[0095]
4)配制流动相2：取纯净水500ml，加入192mg乙酸铵(分析级)，超声脱气，备用；取乙腈(分析级)500ml，加入500ul甲酸+192mg乙酸铵，超声脱气，即流动相a为5mm乙酸铵水溶液，流动相b为5mm乙酸铵乙腈溶液，含0.10％体积比的甲酸；备用；
[0096]
5)配制流动相3：取纯净水500ml，加入192mg甲酸铵(分析级)，超声脱气，备用；取甲醇(分析级)500ml，加入500ul甲酸+192mg甲酸铵，超声脱气，即流动相a为5mm甲酸铵水溶液，流动相b为5mm甲酸铵甲醇溶液，含0.10％体积比的甲酸；备用；
[0097]
而后参照实施例1的条件和方法进行检测。检测结果参见图3
‑
图5，图3为流动相1的检测结果图，图4为流动相2的检测结果图；图5为流动相3的检测结果图。根据此结果可知，在使用乙酸铵作为流动相缓冲盐，甲醇作为流动相b的溶剂时，水溶性维生素整体的保留、分离效果、色谱锋型和灵敏度都优于使用甲酸铵作为流动相缓冲盐或乙腈作为流动相b的溶剂的结果。
[0098]
检验例3
[0099]
评估使用不同萃取液对本发明实施例提供的检测方法的影响
[0100]
1)制备待测样本：取浓度为1mg/ml的各水溶性维生素浓储液；b1、b2、b3、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
oh、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b6
‑
nh2、b7、b9、5
‑
mthf、b12、vc和b13，加入经活性炭吸附处理过的空白血清，配制成含50ng/ml的b1、b2、b3、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
oh、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b6
‑
nh2、b7、b9、5
‑
mthf、b12、vc和b13的血清标准样本；
[0101]
取混合水溶性维生素校准品，以pbs缓冲液为稀释液进行梯度稀释，制备校准曲线工作溶液c1
‑
c6(参见实施例1的表3)：
[0102]
2)配制待测样本1：取所配制的血清标准样本，校准曲线工作液c1～c6、各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及300ul萃取液，萃取液为纯甲醇溶液。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0103]
3)配制待测样本2：取所配制的血清标准样本，校准曲线工作液c1～c6、各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及300ul萃取液，萃取液为甲醇
‑
乙腈混合溶液(体积比为1:1)。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0104]
4)配制待测样本3：取所配制的血清标准样本，校准曲线工作液c1～c6、各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul萃取液，萃取液为10％tca甲醇水混合溶液。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0105]
而后参照实施例1的条件和方法进行检测。检测结果参见图6。对比血清标准品中各待测物的理论值时，发现在使用甲醇或甲醇/乙腈混合溶液萃取血清样本中多种水溶性维生素时，b6
‑
cho无法有效地从血清样本中测得，vc则萃取效率不足。在使用10％tca甲醇水混合溶液萃取时，15种水溶性维生素均可从样本中萃取出，其中b6
‑
cho和vc萃取率优于甲醇或甲醇/乙腈混合溶液，但是b9,5
‑
mthf和b12的萃取率则略低于甲醇或甲醇/乙腈混合溶液。综合考虑到对于15种水溶性维生素的综合萃取效率，优选萃取液为tca甲醇水混合溶液。
[0106]
检验例4
[0107]
评估不同浓度的tca甲醇水溶液对本发明实施例提供的检测方法的影响
[0108]
取所配制的血清标准样本，校准曲线工作液c1～c6(同上)、各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul萃取液，萃取液分别为3％、6％、9％和15％tca甲醇水混合溶液。所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0109]
而后参照实施例1的条件和方法进行检测。检测结果参见图7。对比血清标准品中各待测物的理论值时，发现在使用6％tca甲醇水混合溶液萃取血清样本中多种水溶性维生素时，15中水溶性维生素的综合萃取效果为最佳。
[0110]
验证例5
[0111]
采用表2所示成分的试剂盒进行检测，操作与实施例1相同，区别仅在于采用的检测试剂，例如萃取也为试剂盒内的溶液包，具体地，
[0112]
配制待测样本：取校准曲线工作液c1～c6及多水平质控样本qc
‑
1、qc
‑
2(参见实施例1)各100μl于ep管中，依次加入10μl内标准品is及150ul试剂盒中所含萃取液，所有样本均涡旋振荡3
‑
5分钟，于4℃，2000
‑
4000g离心5
‑
10分钟；离心后移取100
‑
200μl上清液于96孔u型板中,用板垫封紧；
[0113]
而后参照实施例1的条件和方法进行检测。得到结果参见图8
‑
图22，根据图8
‑
22可知，试剂盒测定b1，在0.5
‑
25ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；剂盒测定b2，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b3，在4
‑
200ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b3
‑
nh2，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b5，在5
‑
250ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b6
‑
oh，在0.5
‑
25ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b6
‑
cho，在4
‑
200ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b6
‑
nh2，在1
‑
50ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b7，在1
‑
50ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b9，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定5
‑
mthf，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b12，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定vc，在1
‑
50μg/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b13，在2
‑
100ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99；试剂盒测定b6
‑
cooh，在1
‑
50ng/ml的范围内线性关系良好，r2≥0.99。
[0114]
同时，试剂盒准备提供的多水平质控溶液配制低和高值质控品，每个浓度平行制备6份，分别计算测定值的平均值和标准差sd；每个分析批制备和检测1次，以当批次新制备标准曲线换算质控品浓度，连续3批次，通过计算相对标准差(rsd)来评价批内批间精密度，通过相对偏差(re)来评价批内批间准确度。结果如表3
‑
表17所示：
[0115]
表
‑
3b1批内和批间精密度评价结果
[0116]
[0117]
表4b2批内和批间精密度评价结果
[0118][0119]
表5b3批内和批间精密度评价结果
[0120][0121]
表6b3
‑
nh2批内和批间精密度评价结果
[0122]
[0123][0124]
表7b5批内和批间精密度评价结果
[0125][0126]
表8b6
‑
oh批内和批间精密度评价结果
[0127]
[0128][0129]
表9b6
‑
cooh批内和批间精密度评价结果
[0130][0131]
表10b6
‑
cho批内和批间精密度评价结果
[0132][0133][0134]
表11b6
‑
nh2批内和批间精密度评价结果
[0135][0136]
表12b7批内和批间精密度评价结果
[0137][0138][0139]
表13b9批内和批间精密度评价结果
[0140][0141]
表14 5
‑
mthf批内和批间精密度评价结果
[0142][0143][0144]
表
‑
15b12批内和批间精密度评价结果
[0145][0146]
表
‑
16vc批内和批间精密度评价结果
[0147][0148][0149]
表17b13批内和批间精密度评价结果
[0150][0151]
根据表3
‑
表17可知连续3批的精密度和准确度实验数据，b1、b2、b3、b3
‑
nh2、b5、b6
‑
oh、b6
‑
cooh、b6
‑
cho、b6
‑
nh2、b7、b9、5
‑
mthf、b12、vc和b13的批内和批间精密度rsd及批内批间准确度均在
±
15％之间，满足方法学评价要求。
[0152]
验证例6
[0153]
为了评估pbs缓冲盐替代基质对于血清/血浆样本检测时因基质效应可能导致的结果偏差，对本发明所述的试剂盒在使用过程中可能存在的基质效应也做了相应研究。
[0154]
内源性物质的基质效应可用加标回收率来评估。采用经活性炭吸附去除维生素本底的空白血清基质中添加低和高浓度的质控样品工作液的样品与未加标所得的样品的浓度差值与理论值的比值来评价，各浓度样品均配制6个平行样，参照实施例1的条件和方法进行检测，检测结果如下表：
[0155][0156][0157]
根据上表可知，待测15种水溶性维生素两个质控的加标回收率均在85％～115％之间，表明在使用pbs缓冲液作为替代基质时，与实际人体血清基质具有互换性，不会造成检测方法的结果的偏差。
[0158]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。