一种子宫内膜样腺癌检测试剂及其在子宫内膜样腺癌检测中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种子宫内膜样腺癌的检测方法，尤其涉及一种基于血清寡糖检测(g-test)特异指纹图谱的子宫内膜样腺癌检测方法。


背景技术：

2.子宫内膜样腺癌，是一种起源于子宫内膜的恶性肿瘤，近年来由于持续上升的发病率受到越来越多的关注。2018年，世界范围内的新发病例高达382100例。在发达国家和地区,子宫内膜癌已经成为发病率最高的妇科恶性肿瘤。尽管女性恶性肿瘤的死亡率自2001年起逐年下降，但是子宫内膜癌患者的死亡病例从2012年的76000增加至2018年的89900例。虽然子宫内膜癌通常被认为是一种发生于绝经后的肿瘤，但是研究表明14％的病患为绝经前妇女，而5％的患者甚至小于40岁。子宫内膜癌的发病率增加可能与总体升高的肥胖症和代谢综合征以及人口老龄化有关。
3.不同于卵巢癌早期发病的隐匿性，绝经后罹患子宫内膜癌的患者约90％表现为阴道出血。目前针对异常子宫出血的标准策略为盆腔超声检查，当超声提示子宫内膜厚度异常可能，则进一步采取宫腔镜检查。而根据一项纳入13项研究，针对259例有绝经后阴道出血的子宫内膜癌的荟萃分析显示，当选择子宫内膜厚度5mm为截点，盆腔超声单独诊断子宫内膜癌的敏感性为90％，特异性仅为54％，而当截点降至3mm时，敏感性提高至98％的同时，特异性进一步降至35％。
4.随着宫腔镜技术的发展，宫腔镜在子宫内膜病变的应用越来越广泛，逐渐被人们所接受。宫腔镜下内膜活检成为诊断子宫内膜癌的金标准，相比盲刮宫腔，宫腔镜下活检准确性更高。尽管如此，诊断性宫腔镜在子宫内膜癌的应用仍然存在争议。多项研究发现宫腔镜手术会导致子宫内膜肿瘤细胞脱落，脱落的肿瘤细胞被动地随着灌流液体通过输卵管转移至腹腔从而增加腹腔肿瘤播散。
5.另据报道，绝经后出血的女性经过病理检查，最常见的病因为内膜增生不伴不典型增生，其次依次为生理性、癌性、内膜不典型增生、息肉，其中癌性的构成比仅为8.9％，而14％绝经前子宫内膜癌患者缺乏特异性的临床表现，为早期诊断疾病带来困难。鉴于目前子宫内膜癌并没有公认的特异性的血清标志物可用于筛查，因此能运用于筛查子宫内膜癌的高特异性和高敏感性的生物标志物可以满足临床需求。
6.蛋白质的糖基化(glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(fe2+、ca2+、cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功
能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了n-糖链的改变。
7.糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖链结构的分析方法发展迅速，主要包括(1)高效液相色谱法(hplc)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(ms)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(ce)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如hplc。
8.g-test检测法(glycan-test)是基于dna分析仪的毛细管微电泳技术(dsa-face)，将前列腺液样本中糖蛋白的n-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的n-寡糖链的含量即指纹图谱(简称g-test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种子宫内膜样腺癌监测试剂，通过该试剂测定血清中的糖组图谱，将峰值量化，进行统计学分析，从而提供一种子宫内膜样腺癌的血清糖组图谱模型的建立方法。
10.本发明采用的技术方案如下：
11.一种子宫内膜样腺癌监测试剂，由以下试剂组成：
12.试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的sds配制而成；
13.试剂b：由0.01～10u/10μl糖胺酰酶和0.01～10u/10μl唾液酸酶混合配制而成，混合溶液ph值为4～9；
14.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成，浓度为0.01mm～1m；
15.试剂d：终止液。
16.所述试剂a、试剂b与试剂c的体积比为2：2：1。
17.一种子宫内膜样腺癌检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
18.步骤一 寡糖链的制备
19.在经过灭活处理的2μl血清样品中加入4μl试剂a，进行变性，降温到室温后，加入4μl试剂b，孵育1～6h；
20.步骤二 寡糖链的标记
21.在步骤一得到的液体中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入150μl试剂d终止标记反应；
22.步骤三 寡糖链分离分析
23.取10μl步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
24.优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
25.优选地，所述步骤二中荧光标记的温度为50～90℃。
26.一种组合物在制备子宫内膜样腺癌监测试剂中的应用，所述组合物通过nga2fb/na2f的比值来检测子宫内膜样腺癌。
27.本发明提供一种子宫内膜样腺癌的血清糖蛋白n-糖组图谱模型的建立方法，通过糖测序技术即将糖链进行荧光标记后，用分析仪进行分离，通过测量荧光信号得到的糖测序指纹图谱。
28.材料和方法：
29.一、检测样本：子宫内膜样腺癌患者和hpv阴性对照血清。
30.二、实验设备：糖组分析仪，pcr，离心机。
31.三、试剂制备：
32.试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的sds配制而成；
33.试剂b：由0.01～10u/10μl糖胺酰酶和0.01～10u/10μl唾液酸酶混合配制而成，混合溶液ph值为4～9；
34.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成，浓度为0.01mm～1m；
35.试剂d：终止液。
36.四、糖测序检测步骤：
37.步骤一 寡糖链的制备
38.在经过灭活处理的2μl血清样品中加入4μl试剂a，进行变性，降温到室温后，加入4μl试剂b，孵育1～6h；
39.步骤二 寡糖链的标记
40.在步骤一得到的液体中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入150μl试剂d终止标记反应；
41.步骤三 寡糖链分离分析
42.取10μl步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
43.五、监测对比分析
44.对n-糖组图谱的各个峰值进行量化，然后对子宫内膜样腺癌组和hpv阴性组进行统计学分析，通过糖峰建立模型来预测子宫内膜样腺癌，发现在两组的区分上具有统计学意义(p＜0.05)，通过roc曲线分析说明糖测序检测技术可应用于子宫内膜样腺癌在血液学中的检测。所述组合物通过nga2fb/na2f的比值来检测子宫内膜样腺癌。
45.与现有技术相比，本发明的有益效果：
46.(1)本发明方法采用灵敏度高、操作简单、仅需微量样品、重复性高、稳定性好和高通量的糖测序检测方法，建立了子宫内膜样腺癌患者和hpv阴性对照具有显著差异的糖组图谱模型。在后续应用中，待检测血清的n-糖组图谱用本方法建立的图谱模型来计算，能够对高度怀疑子宫内膜样腺癌的待检测人员的血清进行检测，与现有技术相比，具有更高的特异性以及准确度，对子宫内膜样腺癌癌检测的灵敏度以及特异性分别达到83.0％和87.6％。
47.(2)基于本发明方法构建的糖组图谱模型，能够让众多患者接受常规、无创检测，
帮助医生及患者及时监测子宫内膜癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。
附图说明
48.图1a是hpv阴性图谱，图1b子宫内膜样腺癌图谱；图谱中的寡糖缩写分别表示为：nga2fb，半乳糖缺失带有二等分乙酰葡糖胺修饰的核心岩藻糖两天线(agalacto core-α-1，6-fucosylated bisecting biantennary)；na2f，核心岩藻糖两天线(bigalacto core-α-1，6-fucosylated biantennary)
49.图2是模型建立后的roc曲线图；检测样本通过函数nga2fb/na2f用于鉴别子宫内膜样腺的roc曲线；检测样本总数为43例，其中子宫内膜样腺患者血清16例，hpv阴性对照组血清27例，得到曲线下面积auc＝0.830。
具体实施方式
50.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件，试剂都为细胞培养专用。
51.实施例1检测子宫内膜样腺癌
52.糖测序技术是将糖链进行荧光标记后，用糖组分析仪进行分离，通过测量荧光信号得到的糖测序指纹图谱。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可用于临床推广使用。采用的材料和方法：
53.一、检测样本：子宫内膜样腺癌患者和hpv阴性对照人的血清。
54.二、实验设备：糖组分析仪，pcr，离心机。
55.三、试剂制备：
56.试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的sds配制而成；
57.试剂b：由0.01～10u/10μl糖胺酰酶和0.01～10u/10μl唾液酸酶混合配制而成，混合溶液ph值为4～9；
58.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成，浓度为0.01mm～1m；
59.试剂d：终止液。
60.四、糖测序检测步骤：
61.步骤一 寡糖链的制备
62.在经过灭活处理的2μl血清样品中加入4μl试剂a，进行变性，降温到室温后，加入4μl试剂b，孵育1～6h；
63.步骤二 寡糖链的标记
64.在步骤一得到的液体中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入150μl试剂d终止标记反应；
65.步骤三 寡糖链分离分析
66.取10μl步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
67.五、监测对比分析
68.利用糖测序检测技术对收集的43例子宫内膜样腺癌患者和hpv阴性对照组的血清
样本进行处理，其中子宫内膜样腺患者血清16例，hpv阴性对照组血清27例。对糖测序检测技术测定样本得到的n-糖组图谱进行统计学分析。
69.对n-糖组图谱的各个峰值进行量化，然后对子宫内膜样腺癌组和hpv阴性组进行统计学分析，发现通过糖峰建立模型来预测子宫内膜样腺癌在两组的区分上具有统计学意义，通过roc曲线分析说明糖测序检测技术可应用于子宫内膜样腺癌在血液学中的检测。如图1所示，人血清的糖组图谱中的寡糖链峰显示九个寡糖链，因分子大小的不同而表现出不同的迁移率，不同的峰则代表了不同的寡糖结构，所测出的峰高代表了寡糖链的相对浓度含量，图1a为hpv阴性对照组，图1b为子宫内膜样腺癌组。n-糖组图谱的组合物通过nga2fb/na2f的比值来检测子宫内膜样腺癌。
70.对n-糖组图谱的各个峰值进行量化，然后对子宫内膜样腺癌组(16例)和hpv阴性组(27例)进行统计学分析，通过糖峰建立模型来预测子宫内膜样腺癌，发现在两组的区分上具有统计学意义(p＜0.05)。roc曲线分析显示，模型在检测子宫内膜样腺癌患者中具有显著的临床意义，即auc可达0.830(图2)。由此说明糖测序检测技术可应用于子宫内膜样腺癌在血液中的检测。
71.以上所述的具体实施例，结合附图对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。