一种使用藻蓝蛋白作为荧光探针的环丙沙星检测方法与流程

1.本发明涉及一种使用藻蓝蛋白作为荧光探针的环丙沙星检测方法，属于检测技术领域。


背景技术：

2.环境中的化学污染物对人类和动物构成了巨大威胁。环丙沙星是一种氟喹诺酮类抗生素，由于其广谱的作用，可用于对抗多种革兰氏阴性细菌、某些革兰氏阳性细菌以及一些病毒，广泛用于治疗泌尿道、呼吸道等的感染，被人体组织和体液高度吸收。环丙沙星(cip)经常通过患者的排泄物释放到城市污水中，进而药物残留可能会出现在饮用水中。人体长期暴露于环丙沙星会对细胞、器官和生物体产生过敏反应和毒性作用。
3.有鉴于此，已有大量针对环丙沙星的分析方法报道。其中一些技术包括高效液相色谱法、高效薄层色谱法、、气相色谱法等。这些基于大型分析设备的方法存在成本高、步骤繁琐、使用大量有机溶剂等缺点。基于免疫反应、适配体、显色反应、化学键合等机理的快速检测方法，如比色法和荧光法，具有反应快速、原理简单、可视化观察等优点，一直是快检产品研发的重点。其中荧光测定法由于一定程度上更高的灵敏度、快速响应性和无创性，在检测抗生素等化学污染物方面更具前景。新型荧光探针的开发一直是荧光快检方法最重要的研究内容。
4.藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离出的一种深蓝色水溶性蛋白质，是荧光色素与蛋白质的络合物。藻蓝蛋白是一种纯天然荧光材料，可用于食品添加剂，与化学合成染料相比具有安全、廉价、环境污染小的优点，且稳定性好、亮度高。目前尚无文献报道使用藻蓝蛋白作为荧光探针检测环丙沙星的方法。
5.申请人在研究中发现，藻蓝蛋白与环丙沙星有特异性反应，会导致藻蓝蛋白的荧光发射强度降低。基于此，发展了一种使用藻蓝蛋白作为荧光探针检测环丙沙星的检测方法，可用于研发环丙沙星的快速检测试剂盒。
6.在荧光应用中的化学传感方面，有各种荧光染料和蛋白质被简单使用。在基于荧光测量法检测环丙沙星方面，也使用了不同的蛋白质和有机荧光分子。例如，mehreban和他的团队使用β-乳球蛋白来测定环丙沙星。pawar等人报告了荧光铁载体pyoverdin的应用，这是一种从土壤分离物假单胞菌中提取的非蛋白质色素，用于水介质中的环丙沙星检测。
7.综上所述，利用不同荧光团检测环丙沙星是很重要的。然而，大多数荧光团试剂仍存在问题，由于它们大多数是人工合成的，因此它们有危害性，且存在致癌问题。此外，此类材料的合成需要步骤较多、时间较长，并且在提取过程中还需要较复杂的技术。


技术实现要素：

8.为了解决上述问题，本发明提供了一种新型检测环丙沙星的方法，以藻蓝蛋白作为荧光探针，建立了一种快速、低成本、高灵敏度、选择性好的方法用于环丙沙星的检测。
9.本发明的目的是提供一种检测环丙沙星的方法，包括如下过程：
10.将藻蓝蛋白分散于超纯水中，获得藻蓝蛋白探针溶液；利用缓冲液稀释一系列环丙沙星浓度的样品，获得相应样液，然后与藻蓝蛋白溶液混合，混匀、放置培养，获得混合液；测量混合液的荧光强度值；再利用环丙沙星浓度与相应混合液的荧光强度值构建得到线性检测模型。
11.在本发明的一种实施方式中，藻蓝蛋白溶液的浓度为1-5mg/ml；具体可选2mg/ml。
12.在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为0.01m，ph6.2的pbs缓冲液。
13.在本发明的一种实施方式中，样品与缓冲液的体积比为1：(3-5)；具体可选1：3.5。
14.在本发明的一种实施方式中，样液与藻蓝蛋白溶液的体积比为(6-10):1；具体可选9：1。
15.在本发明的一种实施方式中，混合液中藻蓝蛋白的浓度0.1-0.5mg/ml；具体可为0.2mg/ml。
16.在本发明的一种实施方式中，一系列环丙沙星浓度的范围为0-600μmol/l。
17.在本发明的一种实施方式中，放置培养的时间是10-20分钟；具体可选15分钟。放置培养的温度为室温(20-30℃)；具体可选25℃。
18.在本发明的一种实施方式中，混匀的时间为1分钟，培养的时间为15分钟。
19.在本发明的一种实施方式中，所述藻蓝蛋白溶液储存在4-6℃下备用。所述藻蓝蛋白溶液保存在铝箔包裹的塑料管中。
20.在本发明的一种实施方式中，藻蓝蛋白为40kda藻蓝蛋白粉末。
21.一种环丙沙星的检测方法，具体包括以下步骤：
22.s1：将从蓝色螺旋藻中纯化的藻蓝蛋白粉末(40kda)用超纯水制备藻蓝蛋白储备溶液，储存在冰箱中，直到使用；
23.s2：将待测样品用pbs缓冲液稀释；
24.s3：将稀释过后的样品进一步与藻蓝蛋白溶液混合。
25.s4：混合后，在旋涡中剧烈振荡，然后放置培养，培养后转移至石英反应杯进行测量；
26.s5：测量其荧光强度，并采用标准曲线法，计算溶液中环丙沙星的浓度。
27.本发明还提供了上述检测方法在环保领域中的应用。
28.本发明的优点和效果：
29.本发明使用从蓝藻获得的无毒，环保且易于获取的藻蓝蛋白作为荧光探针，建立了一种快速，低成本，高灵敏度的检测方法用于环丙沙星的检测，检测限达到5μmol/l，且在50μmol/l的浓度下可与其它六种抗生素和六种农药区分开，选择性好。藻蓝蛋白天然、安全，此法也可安全处理。
附图说明
30.图1为藻蓝蛋白的荧光强度(λem＝532nm)随不同浓度环丙沙星(0-120μmol/l)的变化图。
31.图2为5至50μmol/l的环丙沙星浓度范围内荧光强度的标准曲线图。
32.图3为藻蓝蛋白在环丙沙星存在下、与在六种等浓度(50μmol/l)抗生素(pen g、cap、strep.s、kana、ttc、vanco)存在下的荧光强度(图3a)；藻蓝蛋白在环丙沙星存在下、与
methyl)，对硫磷(par-ethyl)，倍硫磷(fenith)，乙拌磷(disulf)，硫代甲醇(thiom)及三氮磷(triaz)进行对比。如图3所示，在每种药物或农药的等浓度(50μmol/l)下，可以很容易地在它们之间区分环丙沙星。
47.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。


技术特征：
1.一种检测环丙沙星的方法，其特征在于，包括如下过程：将藻蓝蛋白分散于水中，获得藻蓝蛋白溶液；利用缓冲液稀释一系列环丙沙星浓度的样品，获得相应样液，然后与藻蓝蛋白溶液混合，混匀、放置培养，获得混合液；测量混合液的荧光强度值；再利用环丙沙星浓度与相应混合液的荧光强度值构建得到线性检测模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，藻蓝蛋白溶液的浓度为1-5mg/ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0.01m，ph6.2的pbs缓冲液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品与缓冲液的体积比为1：(3-5)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样液与藻蓝蛋白溶液的体积比为(6-10):1。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，混合液中藻蓝蛋白的浓度0.1-0.5mg/ml。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一系列环丙沙星浓度的范围为0-600μmol/l。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，放置培养的时间是10-20分钟；具体可选15分钟。9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述藻蓝蛋白溶液储存在铝箔包裹的塑料管中，4-6℃下保存备用。10.权利要求1-9任一项所述方法在环保领域中的应用。

技术总结
本发明公开了一种使用藻蓝蛋白作为荧光探针的环丙沙星检测方法，属于检测技术领域。本发明以无毒、环保、易得的藻蓝蛋白作为荧光探针，建立了一种快速，低成本，高灵敏度的检测方法用于检测环丙沙星的方法，检测限达到5μmol/L，且在50μmol/L的浓度下可与其它六种抗生素和六种农药区分开，选择性好。选择性好。选择性好。


技术研发人员：郭亚辉 王若愚 董菡 逯刚 于航 成玉梁 谢云飞 姚卫蓉 钱和
受保护的技术使用者：杭州傲敏生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2022/3/29