一种测定依折麦布中脱氟杂质的高效液相色谱方法

1.本发明涉及一种依折麦布中脱氟杂质有关物质检测方法，属于药物分析技术领域。


背景技术：

2.依折麦布,英文名ezetimibe，化学名为1-(4-氟苯基)-3(r)-[3-(4-氟苯基)-3(s)-羟丙基]-4(s)-(4-羟苯基)-2-氮杂环丁烷酮。化学结构式如下：
[0003][0004]
依折麦布是由先灵葆雅(schering-plough)公司和默克(merck)公司共同研制开发的选择性胆固醇吸收抑制剂，它对胆固醇吸收的选择性抑制靶点为空肠刷状缘ni-emann-pick c1样蛋白(npc1l1)。多项研究表明依折麦布与他汀类药物联合使用，可进一步提高降脂效能，其独特的作用机制与他汀药物的作用机制具有互补效应。
[0005]
目前报道的依折麦布合成路线有多条，多条路线中最后一步反应均采用了催化氢化反应，此步反应中会产生脱氟杂质a及脱氟杂质b两个副反应产物，参考延边大学岳磊医学硕士学位论文《依折麦布生产中杂质研究与控制的工艺设计方案》中相关研究，这两个杂质的产生与反应体系是否含水及催化剂使用量有关。这两个杂质为同分异构体，结构式与依折麦布仅有一个氟原子的差别，因此很难将其进行完全分离，论文中对两个杂质的熔点、1h-nmr、1c-nmr及在依折麦布片进口注册标准有关物质条件下的保留时间均进行了比较，均一致。依折麦布及依折麦布片被usp收载后，分别采用依折麦布有关物质及依折麦布片有关物质项下的色谱条件对这两个杂质进行分离，发现脱氟杂质a及脱氟杂质b的保留时间均一致，上述条件均无法分离脱氟杂质a及脱氟杂质b。
[0006][0007]
本发明采用苯基己基键合硅胶为填充剂的色谱柱，能够将依折麦布中降解产物环醚、脱氟杂质a、脱氟杂质b和依折麦布同时分离，专属性更强。方法开发过程中发现依折麦布降解产物环醚与脱氟杂质保留时间非常接近甚至一致，因此本方法开发过程中加入了降
解产物环醚，本发明中的方法可将降解产物环醚、脱氟杂质a、脱氟杂质b和依折麦布同时分离，准确检测依折麦布中的脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量，灵敏度高，操作简便，对其工艺研究和生产中这两个杂质的控制具有重要的意义。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种可行性高、操作简便的依折麦布中脱氟杂质的分析方法，该方法能够同时达到依折麦布中降解产物环醚、脱氟杂质a、脱氟杂质b与依折麦布的完全分离和采用外标法准确测定依折麦布中脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量。
[0009]
本发明一种依折麦布中脱氟杂质的高效液相色谱方法的实现包括以下步骤：
[0010]
(1)色谱条件：
[0011]
色谱柱：选用苯基己基键合硅胶为填充剂的色谱柱。
[0012]
流动相：以甲醇-乙醇-0.05％三氟乙酸溶液为流动相，等度洗脱。
[0013]
酸溶液中采用的酸的种类为三氟乙酸、磷酸、甲酸及乙酸中的一种或多种。
[0014]
酸溶液的浓度为0.05％～0.10％。
[0015]
苯基己基硅烷键合硅胶粒度为3～5μm。
[0016]
流速为0.7～0.9ml/min。
[0017]
柱温为25～38℃。
[0018]
采用二极管阵列检测器或紫外检测器，检测波长为230～240nm。
[0019]
进样体积5～10μl。
[0020]
(2)系统适用性溶液：
[0021]
取脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品各适量，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含脱氟杂质a及脱氟杂质b各约50μg的溶液，作为脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品贮备液。取依折麦布对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，分别加入脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品贮备液各1ml，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
[0022]
(3)混合溶液：取降解产物杂质环醚对照品适量，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含环醚50μg的溶液，作为杂质环醚对照品贮备液。取依折麦布对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，分别加入脱氟杂质a、脱氟杂质b及环醚对照品贮备液各1ml，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0023]
(4)供试品溶液的制备：取依折麦布适量，精密称定，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)超声使溶解并制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。
[0024]
(5)测定方法：取系统适用性溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，供试品溶液的色谱图中如有与系统适用性溶液中脱氟杂质a及脱氟杂质b保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，脱氟杂质a及脱氟杂质b均不得过0.1％。
[0025]
本发明的积极效果在于：
[0026]
(1)本发明提供的分析方法已完成方法学验证，包括专属性、线性、精密度、检测限、定量限、脱氟杂质a及脱氟杂质b回收率、供试品溶液稳定性、耐用性，可以准确测定依折麦布中脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量。
[0027]
(2)本发明提供的分析方法灵敏度高。经试验，脱氟杂质的最小检测浓度为0.06μg/ml，相当于供试品溶液浓度的0.006％。
[0028]
(3)本发明提供的分析方法专属性强，能够同时将保留时间较近的杂质(依折麦布降解杂质环醚、脱氟杂质b及脱氟杂质a)分离。有机相改为单纯的乙腈或者甲醇时均不能将其完全分离，因此本方法的专属性更强。
[0029]
(4)本发明提供的分析方法使用普通的仪器设备及色谱柱，流动相简单易得，操作过程简便，可行性高。
附图说明
[0030]
图1空白溶剂的高效液相色谱图
[0031]
图2系统适用性溶液的高效液相色谱图
[0032]
图3供试品溶液的高效液相色谱图
[0033]
图4混合溶液的高效液相色谱图
具体实施方式
[0034]
以下结合附图对本发明实施方式作进一步详细描述。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例，所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0035]
实施例一
[0036]
仪器与色谱条件：
[0037]
(1)高效液相色谱仪：agilent 1260，dad检测器
[0038]
(2)色谱柱：phenomenexphenyl-hexyl，4.6mm
×
150mm，3μm
[0039]
(3)流动相a：甲醇，流动相b：乙醇，流动相c：0.05％三氟乙酸溶液
[0040]
(4)检测条件
[0041]
流动相a、流动相b和流动相c(a:b:c＝36:24:40)等度洗脱
[0042]
检测波长：232nm
[0043]
流速：0.8ml/min
[0044]
柱温：30℃
[0045]
进样体积：10μl
[0046]
实验步骤：
[0047]
取脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品各适量，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含脱氟杂质a及脱氟杂质b各约50μg的溶液，作为脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品贮备液。取依折麦布对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，分别加入脱氟杂质a及脱氟杂质b对照品贮备液各1ml，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。
[0048]
取依折麦布适量，精密称定，加乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)超声使溶解并制成每1ml中约含1mg的溶液，作为供试品溶液。
[0049]
分别精密量取空白溶剂乙腈-水-冰醋酸(60:40:0.1)、系统适用性溶液及供试品
溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的1.5倍，空白溶剂、系统适用性溶液溶液及供试品溶液的高效液相色谱图分别见图1-图3。按照外标法计算供试品中脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量。
[0050]
计算公式如下：
[0051][0052]
式中：ax：供试品溶液中杂质的峰面积
[0053]as
：系统适用性溶液中杂质的峰面积
[0054]cs
：系统适用性溶液中杂质的浓度，mg/ml
[0055]cx
：供试品溶液的浓度，mg/ml
[0056]
结果：
[0057]
从图1-图3可以看出，空白溶剂不干扰依折麦布中脱氟杂质a及脱氟杂质b的测定，图2中，出峰顺序依次为脱氟杂质b、脱氟杂质a及依折麦布，依折麦布峰形良好，且与各杂质分离良好。
[0058]
实施例二
[0059]
仪器与色谱条件：
[0060]
(1)高效液相色谱仪：agilent 1260，dad检测器
[0061]
(2)色谱柱：phenomenex phenyl-hexyl，4.6mm
×
150mm，3μm
[0062]
(3)流动相a：甲醇，流动相b：乙醇，流动相c：0.05％甲酸溶液
[0063]
(4)检测条件
[0064]
流动相a、流动相b和流动相c(a:b:c＝35:23:42)等度洗脱
[0065]
检测波长：235nm
[0066]
流速：0.9ml/min
[0067]
柱温：30℃
[0068]
进样体积：10μl
[0069]
实验步骤：
[0070]
系统适用性溶液、供试品溶液的配制同实施例一
[0071]
计算公式同实施例一
[0072]
实施例三
[0073]
仪器与色谱条件：
[0074]
(1)高效液相色谱仪：agilent 1260，dad检测器
[0075]
(2)色谱柱：phenomenex phenyl-hexyl，4.6mm
×
150mm，3μm
[0076]
(3)流动相a：甲醇，流动相b：乙醇，流动相c：0.1％磷酸溶液
[0077]
(4)检测条件
[0078]
流动相a、流动相b和流动相c(a:b:c＝37:25:38)等度洗脱
[0079]
检测波长：232nm
[0080]
流速：0.7ml/min
[0081]
柱温：25℃
[0082]
进样体积：5μl
[0083]
实验步骤：
[0084]
系统适用性溶液、供试品溶液的配制同实施例一
[0085]
计算公式同实施例一
[0086]
实施例四
[0087]
对脱氟杂质的检测限，定量限，线性进行检测，结果见表1，表2。
[0088]
表1脱氟杂质的检测限，定量限试验结果
[0089][0090]
表2脱氟杂质的线性试验结果
[0091]
名称线性方程r线性浓度范围c(μg/ml)脱氟杂质aa＝29.001c+1.24860.99980.1889μg/ml～5.9044μg/ml脱氟杂质ba＝27.145c+0.56591.00000.1891μg/ml～5.9095μg/ml
[0092]
由表1和表2可以看出，本发明脱氟杂质a及脱氟杂质b的检测灵敏度均较高，并且两个杂质在较低浓度范围内线性关系良好。
[0093]
对脱氟杂质在依折麦布中进行回收率试验，结果见表3。
[0094]
表3脱氟杂质的回收率试验结果
[0095]
名称回收率40％-120％回收率rsd/％脱氟杂质a96.920.76脱氟杂质b101.881.89
[0096]
由表3可以看出，本发明脱氟杂质a及脱氟杂质b在依折麦布中的回收率试验结果良好。
[0097]
取依折麦布供试品溶液，进样并记录色谱图，按外标法计算供试品中脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量，结果见表4。
[0098]
表4依折麦布中脱氟杂质的含量测定结果
[0099]
名称第一批第二批第三批脱氟杂质a未检出未检出未检出脱氟杂质b0.02％0.04％0.04％
[0100]
由表4结果可以看出，依折麦布供试品中含有脱氟杂质b，含量在0.02％-0.04％之间，均未检出脱氟杂质a。
[0101]
本发明能快速，有效，准确的测定依折麦布中脱氟杂质a及脱氟杂质b的含量；本发明具有良好的专属性，降解产物环醚与脱氟杂质b，脱氟杂质b与脱氟杂质a之间，脱氟杂质a与依折麦布之间均能达到良好分离。本发明的专属性好，灵敏度高，回收率高，两个脱氟杂质在较宽浓度范围内线性关系良好，即本发明可以准确测定依折麦布中的两个脱氟杂质的含量，为研究依折麦布合成工艺中两个杂质产生的机理及测定依折麦布中两个杂质的含量提供依据。