一种荧光染色纳米生物质炭及其染色方法和浓度分析方法

1.本发明属于纳米材料技术领域，更具体地说，涉及一种荧光染色纳米生物质炭及其染色方法和浓度分析方法。


背景技术：

2.生物质炭(biochar)，也叫生物黑炭，生物质炭、生物质焦，是由生物残体在低氧或缺氧的环境条件下，经高温热解形成的一类难溶的、稳定的、高度芳香化的、富含碳素的固态物质。生物质炭在土壤改良和环境污染修复方面展现出极大的应用潜力。生物质炭应用到土壤后，改变土壤的属性，使土壤中的营养成分有效性以及持留能力提高，从而提高作物的产量。同时近年因为排放二氧化碳、一氧化二氮及甲烷等温室气体造成气候变迁影响，让科学家开始重视生物质炭之运用，因为它有助于借由生物质炭封存的方式，捕捉与清除大气中的温室气体，将它转化成非常稳定的形式，并储存在土壤中达数千年之久。
3.随着纳米技术的发展，人们已经开始以可持续的方式生成用于土壤和农业应用的纳米生物质炭(nano-bc)。普通生物质炭和纳米生物质炭之间的差异表现在结构随物理化学属性的变化而变化。将生物质炭颗粒尺寸减小到微/纳米尺度，是改善其孔隙率、比表面积(ssa)、流动性等性能的有效途径，也是将次优生物质炭提高到理想的高质量纳米材料即纳米生物质炭的有效途径。纳米生物质炭的制备和应用已经引起了人们越来越多的兴趣。因此，了解其纳米生物质炭环境中的含量和分布，对于提高生物质炭的成本效益以及了解和评价其生态健康风险具有重要意义。
4.由于纳米生物质炭的化学成分复杂，而且很难将纳米生物质炭与其他形式的有机物区分开来，因此目前采用的方法要么是需要大量劳动力，要么需要特定的检测仪器。这两种方法对于大多数的科学常规分析都是不现实的。例如，土壤中的纳米生物质炭通过人工分类，再通过核磁共振光谱法或红外光谱法进行分析，或通过选择性氧化或酸处理优先去除无机物和非生物碳，然后通过核磁共振、光学或质谱分析残留的有机物和生物质炭。这些方法都不适合大多数从事环境研究的农学家或生态学家对环境中纳米生物质炭的常规分析。因此，急需建立一种简单、快速的方法来量化环境中的纳米生物质炭浓度。
5.4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑(nbd-cl)是一种淡黄色的固体，易溶于有机溶剂。因为nbd-cl的结构有硝基苯并恶二唑(nbd)，因此会发出绿黄色荧光(λex，最大值＝约470nm，λem，最大值＝约530nm)。近期研究发现，nbd-cl可将生物质炭染色，因此可用于纳米生物质炭的荧光染色。已有研究开展了通过尼罗红进行微塑料染色的工作，并在荧光显微镜下观察，通过图像识别软件自动计数。但还未有将纳米生物质炭进行染色的工作，并且已有的荧光染色方法存在荧光染色效果不稳定、染色速度慢、抵抗酸性和碱性环境腐蚀能力较差等不足等缺点。


技术实现要素：

6.1.要解决的问题
7.针对现有技术中缺少一种对纳米生物质炭染色的方法、以及现有染色方法的染色效果较差的问题，本发明提供一种荧光染色纳米生物质炭及其染色方法；通过在加热冷却的条件下优化染色流程，克服现有染色的不足，从而有效解决上述问题。
8.针对现有的纳米生物质炭浓度难以分析的问题，本发明提供一种纳米生物质炭浓度分析方法，通过采用本发明的染色方法对纳米生物质炭染色，再获取标准曲线进行定量分析，从而有效解决上述问题。
9.2.技术方案
10.为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
11.本发明的一种荧光染色纳米生物质炭的染色方法，其包括将4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑(即nbd-cl)在有机溶剂中溶解，得到染色液，再将纳米生物质炭放入染色液中进行染色；所述染色的方法包括：对纳米生物质炭和染色液的混合物震荡并升温至t1，在t1温度保温染色20min以上，再将所述混合物置于温度为t2的环境中染色5min以上；所述t1≥25℃，所述t2≤5℃。
12.本发明中的震荡实在磁力搅拌器上搅拌或者超声震荡，搅拌速率为200rpm～400rpm，超声功率为50khz～150khz。
13.优选地，所述染色的具体步骤为：
14.(1)升温染色：对纳米生物质炭和染色液的混合物震荡并以10℃/min～20℃/min的速率升温至t1；
15.(2)保温染色：在t1＝25℃～75℃温度下保温20min～40min；
16.(3)降温染色：将(2)步骤得到的混合物置于t2＝0℃～4℃的冰水浴中冷却5min～15min，得到荧光染色纳米生物质炭。
17.优选地，重复(1)～(3)步骤对纳米生物质炭继续染色1次～5次。
18.优选地，所述4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑的浓度为10mg/l～100mg/l。
19.优选地，所述有机溶剂包括甲醇、正己烷、三氯甲烷其中一种或多种。
20.优选地，将染色后的混合物通过孔径为0.45μm的有机系滤膜真空抽滤，用去离子水冲洗直到滤液澄清，收集滤膜上固体并将其烘干，得到荧光染色纳米生物质炭。
21.优选地，先将纳米生物质炭分散于溶剂中得到5mg/ml～15mg/l的纳米生物质炭悬浮液，再将所述悬浮液与染色液混合得到所述混合物。
22.优选地，所述纳米生物质炭包括纳米豆渣生物质炭、纳米菜籽饼生物质炭、纳米水稻秸秆生物质炭、纳米稻壳生物质炭、纳米玉米秸秆生物质炭、纳米玉米芯生物质炭、纳米大豆秸秆生物质炭、纳米油菜秸秆生物质炭、纳米花生秸秆生物质炭或纳米小麦秸秆生物质炭中的一种或多种。
23.本发明的一种荧光染色纳米生物质炭，所述荧光染色纳米生物质炭由本发明中所述的染色方法制备得到。
24.本发明的一种纳米生物质炭浓度分析方法，采用本发明中所述的染色方法对纳米生物质炭进行染色得到荧光染色纳米生物质炭，通过检测荧光染色纳米生物质炭的荧光强度来判断纳米生物质炭的浓度大小。
25.优选地，具体步骤为：
26.(1)使用荧光分光光度计，在488nm波长处激发荧光染色纳米生物质炭，并测荧光
量染色纳米生物质炭在515nm～525nm波长处的荧光强度，绘制纳米生物质炭质量浓度与荧光强度之间的标准曲线。
27.(2)使用荧光分光光度计，测量待测样品中荧光染色纳米生物质炭的荧光强度，根据标准曲线计算纳米生物质炭的浓度。
28.优选地，所述标准曲线是由多个荧光染色纳米生物质炭浓度下的荧光强度拟合形成，其拟合直线方程为：y＝(0.9～1.1)
×
(400701x+9862.1)。
29.3.有益效果
30.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
31.(1)本发明的一种荧光染色纳米生物质炭的染色方法，将nbd-cl溶解于有机溶剂中，制成染色液，通过染色液对纳米生物质炭样品进行热染色处理，染色效果稳定，速度快，染色流程只需40min左右。
32.(2)本发明的一种纳米生物质炭浓度分析方法，基于本发明的染色方法，能够根据检测出的生物质炭的荧光强度来定量分析其浓度，浓度分析方法准确，适用于研究纳米生物质炭在水环境中的质量浓度，为广大研究学者研究纳米生物质炭在水中的环境行为和归趋提供检测方法。
附图说明
33.图1为倒置显微镜下的荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭；
34.图2为本发明的荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭的标准曲线；
35.图3为本发明的荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭的荧光衰减曲线(1-6)天。
具体实施方式
36.下文对本发明的示例性实施例的详细描述参考了附图，该附图形成描述的一部分，在该附图中作为示例示出了本发明可实施的示例性实施例，其中本发明的特征由附图标记标识。下文对本发明的实施例的更详细的描述并不用于限制所要求的本发明的范围，而仅仅为了进行举例说明且不限制对本发明的特点和特征的描述，以提出执行本发明的最佳方式，并足以使得本领域技术人员能够实施本发明。但是，应当理解，可在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下进行各种修改和变型。详细的描述和附图应仅被认为是说明性的，而不是限制性的，如果存在任何这样的修改和变型，那么它们都将落入在此描述的本发明的范围内。此外，背景技术旨在为了说明本技术的研发现状和意义，并不旨在限制本发明或本技术和本发明的应用领域。
37.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
38.本发明的目的是解决目前纳米生物质炭研究中存在的浓度测试难度大和成本较高的问题。该方法包括以下步骤：一、将染色剂和有机溶剂混合，制备染色工作液；二、将染色工作液与纳米生物质炭混合，振荡染色，过滤烘干得到荧光染色纳米生物质炭；三、对未知样品进行染色并测量荧光强度，采用荧光染色纳米生物质炭浓度与荧光强度之间的标准曲线，分析未知样品中纳米生物质炭的质量浓度。纳米生物质炭荧光染色与浓度分析的结
果表明，该方法能准确定量溶液中纳米生物质炭的质量浓度。本发明具有操作简单、成本低、分析速度快的优点，提供了一种流程短、快速便捷的纳米生物质炭定量分析方法，为环境中纳米生物质炭的迁移转化与归趋研究提供了可靠的研究手段。
39.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
40.实施例1
41.本实施例提供一种荧光染色纳米生物质炭的染色方法，其具体包括以下步骤：
42.a)将10mg nbd-cl染料溶解在100ml有机溶剂(甲醇，色谱级，≥99.9％)中制备染色液，nbd-cl浓度为100mg/l。
43.b)将0.5g的纳米小麦秸秆生物质炭固体重悬浮在50ml体积比是1：1的超纯水和二甲基亚砜混合溶液中，混匀得到。
44.c)向纳米生物质炭悬浮液加入2ml染色工作液得到纳米生物质炭和染色液的混合物，对混合物以100khz功率超声震荡并以15℃/min加热至75℃，在75℃下持续染色30min。
45.d)混合物溶液加热预定时间后，立刻放入0～4℃的冰水浴中冷却10min，利用热胀冷缩的特性，将染料分子固定在纳米生物质炭表面结构中，以增强纳米生物质炭的染色效果。
46.e)将荧光染色纳米生物质炭通过孔径为0.45μm的有机系滤膜真空抽滤，用去离子水冲洗3次，直到滤液澄清，收集滤膜上的固体并在70℃烘箱中烘干，得到如图1所示的荧光染色纳米生物质炭。
47.本实施例还提供一种纳米生物质炭浓度分析方法，基于上述染色方法，具体包括：
48.f)使用荧光分光光度计，在488nm波长处激发染色纳米生物质炭，并测量染色纳米生物质炭在515nm～525nm波长处的荧光强度，绘制纳米生物质炭质量浓度与荧光强度之间的标准曲线。如图2所示，该标准曲线是由多个荧光染色纳米生物质炭浓度下的荧光强度拟合形成，其拟合直线方程为：y＝(0.9～1.1)
×
(400701x+9862.1)，本实施例中可选用y＝400701x+9862.1计算，其中y为荧光强度(a.u.)，x为荧光染色纳米生物质炭的浓度(mg/l)。
49.g)使用荧光分光光度计，测量待测样品中染色纳米生物质炭的荧光强度，根据标准曲线可计算纳米生物质炭的浓度。
50.结果表明，标准曲线的相关系数r2达到0.998，对于已知浓度为110.0mg/l的纳米生物质炭溶液进行检测，本方法检测的纳米生物质炭质量浓度结果为111.5mg/l，说明本方法的定量结果准确可信。如图3所示，在1～6天的时间内，荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭的荧光强度保持在初始荧光强度的82.1％～89.8％之间，说明本方法制备的的荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭稳定性强。
51.实施例2
52.本实施例提供一种荧光染色纳米生物质炭的染色方法，其具体步骤与实施例1基本相同，主要区别在于：
53.本实施例在实施例1的d)步骤后重复c)和d)步骤的染色1次，即：再对混合物震荡并以℃/min加热至75℃，在75℃下持续染色30min，混合物溶液加热预定时间后，立刻放入0～4℃的冰水浴中冷却10min。
54.最终制得荧光染色纳米生物质炭，检测其在1～6天的时间内的荧光强度稳定性，绘制折线图于图3。
55.实施例3
56.本实施例提供一种荧光染色纳米生物质炭的染色方法，其具体步骤与实施例1基本相同，主要区别在于：
57.本实施例在实施例1的d)步骤后重复c)和d)步骤的染色2次，即：再对混合物震荡并以℃/min加热至75℃，在75℃下持续染色30min，混合物溶液加热预定时间后，立刻放入0～4℃的冰水浴中冷却10min；最后再对混合物震荡并以℃/min加热至75℃，在75℃下持续染色30min，混合物溶液加热预定时间后，立刻放入0～4℃的冰水浴中冷却10min。
58.最终制得荧光染色纳米生物质炭，检测其在1～6天的时间内的荧光强度稳定性，绘制折线图于图3。
59.结合实施例1～3可知，本发明的染色方法不但能够对纳米生物质炭有效染色，纳米生物质炭浓度的定量分析，还具有优异的染色稳定性。参照图3，本发明采用循环升温-保温-降温染色能够进一步提升染色稳定性，申请人发现，当循环第三次(实施例3)得到的荧光染色纳米小麦秸秆生物质炭的荧光强度保持在初始荧光强度的94.7％～98.4％之间，荧光染色纳米生物质炭稳定性达到饱和，当继续增加循环次数效果增益不大，因此判断3次循环为最优实施方式。
60.在其他实施例中，采用的纳米生物质炭还可以是：纳米豆渣生物质炭、纳米菜籽饼生物质炭、纳米水稻秸秆生物质炭、纳米稻壳生物质炭、纳米玉米秸秆生物质炭、纳米玉米芯生物质炭、纳米大豆秸秆生物质炭、纳米油菜秸秆生物质炭、纳米花生秸秆生物质炭或纳米小麦秸秆生物质炭中的一种或多种，本发明对此不再赘述。
61.在上文中结合具体的示例性实施例详细描述了本发明。但是，应当理解，可在不脱离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下进行各种修改和变型。详细的描述和附图应仅被认为是说明性的，而不是限制性的，如果存在任何这样的修改和变型，那么它们都将落入在此描述的本发明的范围内。此外，背景技术旨在为了说明本技术的研发现状和意义，并不旨在限制本发明或本技术和本发明的应用领域。
62.更具体地，尽管在此已经描述了本发明的示例性实施例，但是本发明并不局限于这些实施例，而是包括本领域技术人员根据前面的详细描述可认识到的经过修改、省略、例如各个实施例之间的组合、适应性改变和/或替换的任何和全部实施例。权利要求中的限定可根据权利要求中使用的语言而进行广泛的解释，且不限于在前述详细描述中或在实施该申请期间描述的示例，这些示例应被认为是非排他性的。在任何方法或过程权利要求中列举的任何步骤可以以任何顺序执行并且不限于权利要求中提出的顺序。因此，本发明的范围应当仅由所附权利要求及其合法等同物来确定，而不是由上文给出的说明和示例来确定。
63.除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。质量、浓度、温度、时间、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，1-50的范围应理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的
任何数字、数字的组合、或子范围、以及所有介于上述整数之间的小数值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，具体考虑从范围内的任意端点开始延伸的“嵌套的子范围”。例如，示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括一个方向上的1-10、1-20、1-30和1-40，或在另一方向上的50-40、50-30、50-20和50-10。