专利名称：白血球分析用试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及在临床检查领域中，使用白血球分类装置将白血球分类计数时所需的白血球分析用试剂。
临床检查领域中，用患者的全血对白血球分类计数的工作，在诊断各种疾病时是很重要的。
鉴于这种目的，已发表了许多装置和方法。
这些装置是根据，例如RF信号强度(高频电阻的变化)、DC信号强度(悬浮粒子和将其悬浮的流体介质之间的电导率不同而引起电流变化)、萤光强度、散射强度、吸光度、偏振光解消散射光等的差异，将白血球按细分类集团(淋巴球，单核细胞，嗜中性白细胞，嗜酸性白细胞、嗜碱细胞)进行分类。在白血球分类计数时，必须溶解红血球，并对白血球进行前处理，以致可以用上述那些参数检测出各种白血球的差异。
因此，例如用溶血剂将白血球收缩成适当大小，同时将特定的细胞染色。作为使用溶血剂将白血球收缩成适当大小的方法，可例举使用有机羧酸、有机磺酸、酚类的方法(特表平1—502931号公报)、和使用阳离子性表面活性剂的方法(WO 84/02777号)等。此外，作为溶解红血球以使特定的细胞染色方法，已知有用皂角苷和/或十二烷基硫酸钠、叔或季铵盐、乙醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯、戊二烷醛或甲醛，亚烷基乙二醇，生理学的盐和氯唑黑(Chlorazolblack)的组合物(特开平3—266999号公报)，十二烷基硫酸钠、甲醛、糖(或糖醇)及缓冲剂组合起来的试剂处理血液后，进行过氧化酶染色的方法(特开昭62—71857号公报)。
在上述的WO 84/03771号和WO84/02777号中，白血球的分类计数是根据DC信号强度的不同进行测量，虽然简便，但仍有只能将白血球分成3类的问题。
此外，可以将白血球分成4类以上的细分类集团的方法中，特开昭62—71857号公报，特开平3—2366999号公报中提出，需要高温处理和用具有毒性的醛进行固定处理。
在特表平1—502937号公报中公开了，根据RF信号，DC信号、散射光强度来检测白血球的方法，但检测器复杂且装置大型化，具有价格昂贵的问题本发明是鉴于以上课题做出的发明，其目的是提供，不用醛那样的有毒药剂，并且，使用价格低廉且构造简单的装置就能将白血球分类成至少为4种细分类集团的试剂。
按照本发明的白血球分析用试剂，则可提供由(a)可以溶解红血球并能使白红球细胞膜的一部分损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂和，(b)与白血球内的阳离子荷电成分相结合从而能在白血球间给予足够形态差异的至少一种具有阴离子基团的有机化合物和，(c)非离子表面活性剂和，(d)pH调整用的缓冲剂组成的白血球分析用试剂。
本发明的白血球分析用试剂中的离子性表面活性剂，含有阳离子性表面活性剂及两性表面活性剂中的至少一种。作为阳离子性表面活性剂，优选是季铵盐型表面活性剂或吡啶嗡盐型表面活性剂，季铵盐型及吡啶嗡盐型表面活性剂，可例举下式表示的总碳数为9～30的表面活性剂， 或 (式中，R1是碳数为6～18的烷基或链烯基，R2和R3是碳数为1～4的烷基或链烯基，R4是碳素为1～4的烷基及链烯基或苄基，X是卤原子)，作为R1的碳数为6～18的烷基或链烯基，可例举己基，辛基，癸基，月桂基、十四烷基等，尤其优选辛基，癸基、月桂基等直链的烷基。作为R2和R3的碳数为1～4的烷基，链烯基，可例举甲基，乙基，丙基，丁基等，尤其优选甲基，乙基，丙基等碳数为1～3的烷基。作为R4的碳数为1～4的烷基及链烯基，可例举甲基，乙基，丙基，丁基等，尤其优选甲基，乙基，丙基等碳数为13的烷基。
此外，作为两性表面活性剂，可例举下式表示的总碳数为9～30的两性表面活性剂， (式中，R1、R2和R3与上述定义相同)。上述离子性表面活性剂的使用量，应该是能溶解红血球而且能使白血球细胞膜的一部分充分地损伤。具体说，使用量约为30～5000mg/l，较好约为50～3000mg/l，更好约为100～2000mg/l，可以通过表面活性剂的种类来适当调整。各种表面活性剂的适宜使用量示于表1中。这些表面活性剂可以1种单独使用，也可1种以上组合使用。
表1
也就是，离子性表面活性剂，是相对于白血球能使那些允许后述的有机化物通过程度的细孔打开的溶血力就行，而不需要将细胞裸核化那样的强溶血力。因此，通常用的阳离子性表面活性剂(例如LTAC，MTAB，CTAC)都可以使用，但为了抑制溶血力，通常是，比使白血球裸核化时所用量少得多的量为适宜。此外，由于仅去除细胞膜的一部分就可以，因此也可使用溶血力小的表面活性剂。表面活性剂的溶血作用在于与疏水基团的碳数成比例关系，碳数越多溶血力越强，因此最好使用溶血力低的，例如DTAB，OTAB等阳离子性表面活性剂或两性表面活性剂。
本发明的白血球分析用试剂，除离子性表面活性外，还包括具有与白血球内的阳离子荷电成分相结合从而在白血球间，提供形态差异的阴离子基团的有机化合物，即可例举具有疏水性官能团和酸性官能团(阳离子基团羧基、磺酸基)、而且在水溶液中带阴电荷，碳数至少是6以上，通过与白血球结合而使白血球的形态变化的物质。关于它的种类，没有特别的限定，几乎全部的酸性色素都可以使用。此外，由于没有必要测定吸光度和萤光强度，还可使用色素以外的有机化合物。作为酸性色素的例子，可以是从下列酸性色素选出的至少一种色素酰胺黑(Amido Black，色号20470)、茜素花青绿F(Alizalin cyanine Green F，色号61570)、酸性绿27(Acid Green27，色号61580)、酸性蓝62(Acid Blue 62，色号62045)、直接红31(Diret Red 31，色号29100)、亮硫化黄素(Brilliant Sulphaflarine，色号56205)、茜素黄R(Allzaline Yellow R，色号14030)、酸性蓝129(Acid Blue 129，色号62058)、酸性绿25(Acid Green 25，色号61570)、铬变素2R(Chromotrope 2R，色号16570)、考马斯亮蓝R—250(Coomassie Brilliant Blue R—250，色号42660)、胭脂红酸(CarmineAcid色号75470)、考马斯亮蓝G—250(Coomassie Brilliant Blue G—250，色号42655)、淡红B(Carmoisine B，色号14720)、直接蓝86(Direct Blue 86，色号74180)、乙基红(Ethyl Red即[2—(4—diethy-laminophenylazo)benzoic acid]，色号不明)、副品红(Para Rosaniline，色号42500)、紫胺R(Violaminc R，色号45190)、酸性黄34(AcidYellow 34，色号18890)、酸性橙51(Acid Orange 51，色号26550)、亮藏花精MOO(Brilliant Crocein MOO，色号27290)、尼基绿(GuineaGreen B，色号42085)、酸性蓝29(Acid Blue 29，色号20460)、若丹明B(Rhodamine B，色号45170)、硫氰酸胺B(Sulforhodamine，B，色号45100)、丽丝胺绿B(Lissamine Greem B，色号44090)、酸性蓝9(Acid Blue 9，色号42090)、坚牢绿FCF(Fast Green FCF，色号42053)、偶氮胭脂红B(Azocarmine B，色号50090)、苯胺蓝(AnilineBlue，色号42780)、变色绿A(Alphazurine A，色号42080)、茜素紫3R(Alizaline Violet 3R，色号61710)、酸性蓝41(Acid Blue 41，色号62130)、バイブリツヒスカ-レツト(Bieblich Scarlet，色号26905)、赤藓红B(Erythrosin B，色号45430)、甲基红(Metyl Red，色号13020)、甲基橙(Methyl Orange，色号13025)、一号橙(Orang1，色号1 4600)此外，作为色素以外的有机化合物例子，可使用具有疏水性官能团和酸性官能团的芳香族有机酸，具有碳数为6以上的烃和杂环酸等，具体可例举，8—苯胺基—1—萘磺酸或其盐类，6—(对甲苯胺基)—2—萘磺酸或其盐类，铬变酸，苯二甲酸，萘磺酸等。这些有机化合物的使用量，可根据所用的表面活性剂的种类适宜选择，以50～500mg/l为好，优选100～3000mg/l。
本发明的白血球分析用试剂，还含有非离子表面活性剂。作为非离子表面活性剂，没有特别的限定，一般作为增溶剂使用的几乎全部的非离子性表面活性剂都可使用。具体说，具有聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇—聚丙烯乙二醇(POE—POP)嵌段共聚物作为亲水基团的非离子性表面活性剂为适宜。使用1种非离子性表面活性剂时，由于细胞构成成分和离子性表面活性剂结合而形成的不溶化物具有可溶化的效果，与此同时往往出现同时使白血球也溶解的副作用。在这种情况下，最好是将多种非离子性表面活性剂，例如亲水基的加聚摩尔数不同的非离子性表面活性剂组合使用。或者，如果将亲油基结构不同的非离子性表面活性剂组合使用，就可以抑制副作用。使不溶物变成可溶化所必须的非子离子性表面活化剂的量，根据所用的离子性表面活化剂种类而异，一般为0.5～10g/l，优选1～8g/l。
本发明的白血球分析用试剂，还含有pH调整用的缓冲剂。作为缓冲剂，使用能将pH保持为一定数值的物质就行，没有特别的限制，可以使用在规定的pH±2.0具有pKa的缓冲剂。具体可例举NES，TRIS，HEPES，琥珀酸，苯二甲酸，柠檬酸缓冲液等。在本发明中，最好调至pH5～11的范围。此时的使用量为5～100mM左右。
作为可在本发明中使用的醇类，没有特别的限定，优选价廉的在工业上容易制得的醇类。例如，甲醇，乙醇等的烷醇，苯乙醇，2—苯氧基乙醇等具有芳香环的醇类等。此时的使用量，当用甲醇时，相对于试剂组合物总量，最佳使用量为5～20％左右，大致的目标是，碳数每增加1个，使用量最好约为一半。当用2—苯氧基乙醇时，优选其使用量为0.05～1％。
作为可在本发明中使用的金属盐类，没有特别限定，例如以氯化钠，氯化钾，氯化锂等碱金属盐为宜。碱金属盐，通常不需要，但如后所述，在使用电阻信号进行测定的装置中，为了进行测定将试料的电导率调整至适宜值时，都是必需的。此时的碱金属盐使用量，最好是使溶液的电导率在5～20mS的范围内。
本发明的白血球分析用试剂是由，含有具有与白血球内的阳离子荷电成分结合以致在白血球间赋予形态差异所需要的足够量的至少一种阴离子基团的有机化合物的第1溶液和，含有能溶解红血球并能使白血球细胞膜的一部分造成损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂的第2溶液构成，第1溶液和第2溶液的至少任何一种含有，最好是两种中都含有，非离子性表面活性剂，pH调整用的缓冲剂。和1种溶液构成的试剂相同，也可进一步含有醇和金属盐。各成分的浓度，在第1溶液和第2溶液混合时，调整成上述各成分的浓度就行。由于由2种溶液构成，因而可提高试剂保存的稳定性。
本发明的白血球分析用试剂中，特别是用半导体激光的小型分析装置中，可以很好地进行白血球分类计数。也就是，由于仅是接受低角和高角前方散射光的2个参数，很适合在能对白血球分类计数的装置中使用，作为分析装置，没有特别的限定，例如可用图21中示出的具有简单检测部的装置。图21的装置，具备2角度前方散射光检测部。即，在图21的装置中，在流体室(フロ-セル)CELL的前方，使聚光镜L2和平行光管透镜L1介于中间，配置有半导体激光LD。在流体室CELL的后方使并置有射束制动器BS的会聚透镜介于中间，设置有光电二极管PD。通过这种装置，可在散射的前方方向的散射光中测定低角度(1～5°)和高角度(5～20°)2种散射光强度，根据散射光强度之差，就可将白血球分类计数成至少4种。
本发明的白血球分析用试剂，是在水或水性介质中按规定量含有上述离子性表面活性剂、有机化合物，非离子表面活性剂、缓冲剂，该白血球分析用试剂的使用量，最好是相对于血液试料1体积，其用量为2—100体积。
本发明的白血球分析用试剂；是由可溶解红血球并能使白血球细胞膜的一部分损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂，和具有与白血球内的阳离子荷电成分相结合以致能在白血球间赋予形态差异的足够量的至少一种阴离子基团的有机化合物，和非离子性表面活性剂，和调整pH用的缓冲剂组成，因而适于用流体检查计对白血球进行分类计数。
在本发明中；①离子性表面活性剂的作用是，溶解全血中的红血球，损伤白血球的细胞膜，促进有机化合物的细胞膜透过性；②有机化合物的作用是，调整白血球的形态信息资料，使它适宜于对白血球分类；③非离子性表面活性剂的作用是，通过离子性表面活性剂和有机化合物的结合，使产生的不溶物变成可溶化；④缓冲剂的作用是，将试剂组合物的pH保持在一定值。
一般，离子性表面活性剂用于使红血球溶血，使白血球的细胞膜溶解，并裸核化，通过测定此时的体积信息资料，将白血球3分类的方法，作为简便的白血球分类法，已被广泛地使用。然而用这种方法，溶血力过强以致白血球几乎裸核化，不能将白血球进行细分类形态的分类。另一方面，在本发明中，基本与上述方法相同，利用离子性表面活性剂的溶血力来使红血球溶血，并使对白血球的细胞膜给予损伤。然而本发明中的细胞阻碍作用，是除去细胞膜的一部分，或许是脂质成分的一部分，如果是红血球则能使血红蛋白通过，如果是白血球则能使那些允许有机化合物通过程度的细孔打开程度的溶血力，而不是那种使细胞裸核化的强的溶血力。通过这种处理，由于红血球流出血红蛋白，使得光几乎不散射，这样根据光学的信息资料，就能区别出白血球。由于白血球的一部分受损，使得细胞膜的一部分和细胞内液流出，因此使得由细胞表面引起的光的散射光显著减少，于是可获得更详细的细胞内部的信息资料。
离子性表面活性剂的可溶化性，众所周知，按表面活性剂的CMC以上的浓度，随浓度而增加。在以前的方法中，是利用这种表面活性剂的可溶化能使白血球裸核化，而在本发明中以低浓度使用表面活性剂，因而表面活性剂的可溶化能低，这是以前没有预期到的这样，由于离子表面活性剂的正电荷将细胞的阴离子性成分(核、颗粒、RNA等)的负电荷中和，因此不溶化。其结果是，即使用表面活性剂处理白血球其细胞形态也几乎不变化，可得到类似于用醛类固定细胞的细胞形态保持效果。因此，以使用上述阳离子性表面活性剂的3分类试剂调制试料时，出现问题的处理时间，处理温度而引起的变化，在用本发明试剂时几乎都不会产生，调制过的试料在长时间内保持稳定。
在本发明中，由于有机化合物起作用，使白血球细胞内的阳离子性成分，例如颗粒(特别是嗜酸性白血球颗粒)、蛋白质等不溶化，就可得到与用醛类固定时同样的效果，或许，相应于阳离子性成分的量，导致在白血球间产生形态差异，例如散射光的差异。即，由于将细胞内阳离子性成分的正电荷中和以致不溶化，阻止向细胞外流出，保持白血球的形态信息资料，进而使之变化成适于对白血球的形态进行分类。
在本发明中，非离子性表面活性剂可使由于离子性表面活性剂和有机化合物结合而生成的不溶物可溶化。
而且，本发明中还存在少量的离子性表面活性剂，因此可抑制过度的可溶化作用。
本发明中，醇类不一定是必需的，但如果添加它，以下各点会更有效果。由于醇类具有选择性地增强离子性表面活性的作用，因此，即使是低浓度的离子性表面活性剂也能使细胞膜损伤。而且，醇类还有使细胞中含的蛋白质变性，而具有不溶化的作用。因此，通过使用醇类，给损失细胞质和颗粒等的细胞带来的损伤为最小，但却能获得细胞膜损伤。因此，具有保持散射光等的光学差异的效果。而且，还有促进红血球溶解的作用。因此，在肝硬变等疾病中，虽然很难使其红血球膜溶解，在这种情况下如果添加醇类，则可使难溶解的红血球溶解，但却能抑制白血球的损伤。这被认为是，醇类可能是以与离子表面活性剂不同的机理来损害红血球的细胞膜。
实施例本发明的白血球分析用试剂的最佳组成，如下所示。
实施例1离子表面活性剂 100～500mg/l8—苯胺基—1—萘磺酸Mg盐(有机化合物)2g/l
BC30TX(非离子性表面活性剂聚氧乙烯(30)十六烷醚日光テミカルズ(株)) 1g/lHEPES 10mM甲醇 100ml/lNaOH 使pH为7.0时的量作为离子性表面活性剂，使用各种浓度的各种表面活性剂的情况下，将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。
在
图1～4中示出，作为离子性表面活性剂，使用溴化癸基三甲基铵(DTAB)750mg/l，氯化月桂基三甲基铵500mg/l、溴化十四烷基三甲基铵500mg/l，溴化十六烷基三甲基铵100mg/l的结果。图中，L表示淋巴细胞，M表示单核细胞，N表示嗜中性白细胞及嗜碱细胞，E表示嗜酸性白细胞。使用任何一种离子性表面活性剂，都可得到大致相同的散布图象，并能对白血球分类计数。
实施例2DTAB(阳离子性表面活性剂) 1.5g/l有机化合物0.3～3g/lDC 30TX(非离子性表面活性剂，日光ケミカルズ(株))1g/l柠檬酸50mM
甲醇 100ml/lNaOH 使pH为7.5时的量作为有机化合物，使用各种浓度的各种化合物的情况下，将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。
在图5～8中示出，作为有机化合物，使用茜素紫3R，3g/l；变色绿A，0.3g/l；尼基绿B，0.3g/l；茜素黄—R，3g/l时的结果，使用任何一种有机化合物都可获得大致相同的散布图象，并能对白血球分类计数。
实施例3DTAB 1.5g/l亮藏光精MOO(有机化合物) 1g/lHEPES 10mMHCO50(非离子性表面活性剂聚氧乙烯(50)硬化蓖麻油、日光ケミカルズ(株)) 4g/l醇类 适当量NaOH 使pH为7.0时的量使用各种浓度的各种醇的情况下，将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。
图9～12中示出，作为醇类，使用甲醇100ml/l，乙醇500ml/l，异丙醇25ml/l 2—苯氧基乙醇2.5ml/l时的结果。添加醇时，使用任何一种醇，都能使红血球充分地收缩，因而能计数白血球，可获得大致相同的散布图象，可将白血球分类计数。
实施例4DTAB 1.5g/l8—苯胺基—萘磺酸Mg盐(有机化合物)2g/lHCO50(非离子性表面活性剂、日光ケミカルズ(株))4g/l缓冲剂 10mM2—苯氧基乙醇2.5ml/lNaOH 适当量为了变化pH，作为缓冲剂，使用各种缓冲剂的情况下，将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。
图13中示出使用MES(pH5.5)时，图1 4中示出使用HEPES缓冲液(pH7.0)时，图15中示出TRIS缓冲液(pH 8.5)时的结果。随着pH的上升，白血球的散射光强度有降低的倾向，但可以对白血球进行分类计数。
实施例5DTAB 1.0g/l8—苯胺基—萘磺酸Mg盐(有机化合物) 1.5g/lBC—25TX(非离子性表面活性剂聚氧乙烯(25)十六烷基醚、日光ケミカルズ(株))30g/lHEPES 10mM甲醇 100ml/lNaOH 使pH为7.0时的量将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。
图16中示出，为了使得由于细胞构成成分和离子性表面活性剂的结合而形成的沉淀物可溶化，使用BC—25TX3.0g/l作为非离子性表面活性剂时的结果。图16中可看出，不仅有沉淀物的可溶化效果，同时对白血球也有影响，白血球中，嗜酸性白细胞以外的白血球W收缩了，不能进行4分类。
此处，作为非离子性表面活性剂，将BC—25TX用量降低为2.0g/l，作为补偿，如果添加聚氧乙烯硬化蓖麻油的HCO—60(日光ケミカルス(株)、聚氧乙烯的加聚摩尔数为60)1.0g/l，如图17所示，没有沉淀物生成，从而获得能将白血球4分类的良好的散布图象。
实施例6DTAB 1.5g/l8—苯胺基—1—萘磺酸Mg盐(有机化合物) 2g/lHCO—50(非离子性表面活性剂，日光ケミカルズ(株))4g/lPEN4630(非离子性表面活性剂聚氧乙烯(30)聚氧丙烯(6)2—癸基—十四烷基醚，日光ケミカルズ(株)) 1g/l苯二甲酸 50mM2—苯氧基乙醇 2.5ml/lNaOH 使pH为5.5时的量NaCl 30mM将上述组成的试剂1ml和血液30μl混合，30秒后用流体检查计测定。
图18中示出，为了测定大小方面的信息资料而测定前方低角散射光，为了测定形态方面的信息资料而测定前方高角散射光的结果。图19中示出，根据特开平5—34251中记载的为了用可测定电阻信号的流体检查计测定大小方面信息资料的电阻式测定原理，来测定体积，和为测定形态方面的信息资料而测定侧方散射光的结果。
实施例7[第1溶液]8—苯胺基—1—萘磺酸NH4盐(有机化合物)3.0g/lHCO—50 5.0g/lPEN 4630 1.3g/l苯二甲酸 2.5g/l琥珀酸2Na·6H2O 13.5g/l2—苯氧基乙醇2.5g/lNaOH 将pH调至5.3时的量NaCl 2.9g/l[第2溶液]在第1溶液的成分中，代替8—苯胺基—1—萘磺酸NH4盐，加入DTAB6.9g/l，其它成分和浓度均与第1溶液相同。
用第1溶液1ml将血液33μl稀释后，添加第2溶液0.2ml，于35℃反应20秒后用流体检查计测定前方低角散射光和前方高角散射光。测定结果示于图21。像上述那样作为二种溶液结构也能将白血球很好地进行分类。
上述试剂组合物，是基于电阻式测定原理进行测定，因此可以通过添加氯化钠将其组分调制成适于测定试料的导电率的最佳值。
使用任何测定参数都能明确地使白血球分类计数。
本发明的白血球分析用试剂，基本上是由1种水溶液组成，由于该试剂组合物可以调制成只需要将本发明试剂和血液试料混合的简单工序就能进行白血球分类计数，因此只需测定2种散射光信号就能使白血球分类，从而可采用构造简单的装置。
而且，由于不使用醛之类的危险试剂，因而可安全操作地进行血液试料的分类计数。
以下简单说明附图。
图1是表示，在本发明涉及的白血球分析用试剂中，作为离子性表面活性剂，使用氯化癸基三甲基铵时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图2是表示，在本发明涉及的白血球分析用试剂中，作为离子性表面活性剂，使用氯化月桂基三甲基铵时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图3是表示，在本发明涉及的白血球分析用试剂中，作为离子性表面活性剂，使用溴化十四烷基三甲基铵时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图4是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为离子性表面活性剂，使用氯化十六烷基三甲基铵时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图5是表示，在涉及在本发明的白血球分析用试剂中，作为有机化合物，使用茜素紫3R时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图6是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为有机化合物，使用变色绿A时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图7是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为有机化合物，使用尼基绿B时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图8是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为有机化合物，使用茜素黄—R时的前方低角散射光度强度和前方高角散射光强度的散布图。
图9是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为醇类，使用甲醇时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图10是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为醇类，使用乙醇时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图11是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为醇类，使用异丙醇时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图12是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为醇类，使用2—苯氧基乙醇时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图13是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为缓冲剂，使用MES时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图14是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为缓冲剂，使用HEPES时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图15是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为缓冲剂，使用TRIS时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图16是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为非离子性表面活性剂，使用BC—25TX时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图17是表示，在涉及本发明的白血球分析用试剂中，作为非离子性表面活性剂，组合使用BC—25TX和HCO—60时的前方低角散射光强度和前方高角散射光强度的散布图。
图18是表示，涉及本发明的白血球分析用试剂的前方低角散射强度和前方高角散射光强度的散布图。
图19是表示，涉及本发明的白血球分析用试剂的基于电阻式测定原理的体积和侧方散射光强度的散布图。
图20是表示对用白血球分析用试剂处理过的试料进行测定时所用装置的示意图。以下是图中符号说明。L 淋巴细胞M 单核细胞N 嗜中性细胞及嗜碱细胞E 嗜酸性白细胞CELL 流体室L1 平行光管透镜L2 聚光镜L3 会聚透镜BS 射束制动器PD 光电二极管W 嗜酸性白细胞以外的白血球
权利要求
1.白血球分析用试剂，它由以下物质组成(a)能溶解红血球并使白血球的细胞膜的一部分损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂；和(b)具有与白血球内的阳离子荷电成分相结合以致在白血球间给予形态差异的足够量的至少一种阴离子基团的有机化合物，和(c)非离子性表面活性剂，和(d)pH调整用缓冲剂。
2.根据权利要求1所述的白血球分析用试剂，其中，还含有醇类。
3.根据权利要求1或2所述的白血球分析用试剂，其中，还含有金属盐类。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的白血球分析用试剂，其中，离子性表面活性剂是下式表示的总碳数为9～30的阳离子性表面活性剂中的至少一种 或 (式中，R1是碳数为6～18的烷基，链烯基；R2和R3是碳数为1～4的烷基、链烯基；R4是碳数为1～4的烷基、链烯基或苄基，X是卤原子)。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的白血球分析用试剂，其中，离子性表面活性剂是下式表示的总碳为9～30的两性表面活性剂中的至少一种， (式中，R1，R2和R3和上述定义相同)。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的白血球分析用试剂，其中，有机化合物是碳数至少为6以上，并具有疏水性官能团和阴离子基团，并且在水溶液中带负电荷，与白血球结合，因而能使白血球的形态变化的物质。
7.根据权利要求6所述的白血球分析用试剂，其中，有机化合物是选自8—苯胺基—1—萘磺酸或其盐类，6—(对甲苯胺基)—2—萘磺酸或其盐类，铬变酸，苯二甲酸、萘磺酸或酸性色素中的至少一种。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的白血球分析用试剂，非离子性表面活性剂是具有选自聚氧乙烯乙二醇，聚丙烯乙二醇或聚氧乙烯乙二醇—聚丙烯乙二醇嵌段共聚物的化合物中至少一种作为亲水基团的非离子性表面活性剂。
9.根据权利要求1～8所述的白血球分析用试剂，其中，它含有2种以上的权利要求8所述的非离子性表面活性剂。
10.根据权利要求1～9所述的白血球分析用试剂，其中，离子性表面活性剂的使用浓度约为30～5000mg/l。
11.根据权利要求1～10所述的白血球分析用试剂，其中，有机化合物的使用浓度约为50～5000mg/l
12.根据权利要求1～11所述的白血球分析用试剂，其特征在于，它是由含有具有与白血球内的阳离子荷电成分相结合以致在白血球间赋予形态差异所需的足够量的至少一种阴离子基团的有机化合物第1溶液，和含有能溶解红血球并能给白血球的细胞膜的一部分造成损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂的第2溶液构成，第1溶液和第2溶液的至少任何一种中含有非离子性表面活性剂，pH调整用缓冲剂。
全文摘要
本发明涉及白血球分析用试剂，它是由(a)可溶解红血球并使白血球细胞膜的一部分损伤的足够量的至少一种离子性表面活性剂和，(b)具有与白血球内的阳离子荷电成分相结合以致在白血球间给予形态差异的足够量的至少一种阴离子基团的有机化合物和，(c)非离子性表面活性剂和，(d)pH调整用缓冲剂组成。由于基本上是由1种水溶液组成，该试剂组合物可以调制成只需要将本发明试剂和血液试料混合的简单工序就能进行白血球分类计数，因此只需测定2种散射光信号就能使白血球分类，从而可采用构造简单的装置。而且不使用醛之类的危险试剂，可安全操作进行分类计数。
文档编号G01N33/49GK1127886SQ94119539
公开日1996年7月31日 申请日期1994年12月20日 优先权日1993年12月22日
发明者坂田孝, 森川隆, 内桥欣也, 桥本智美 申请人:东亚医用电子株式会社