专利名称：：用于分析物的光度测定的稳定的偶合染料的制作方法
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：本发明是1994年9月8日申请的待批的，序号为08/302,575的美国申请的部分继续申请。本发明是一项关于比色测定含水流体，如全血，中的化学和生物化学组份(分析物)的测试装置和方法的发明，尤其是关于用于这种装置和方法中的偶合染料的发明。经染色的含水流体，尤其是经染色的生物流体，如全血和尿，以及生物流体的派生物，如血清和血浆中的化学和生物化学组份的定量分析正变得日益重要。在医疗诊断和治疗中，和在所接触治疗药剂、麻醉剂、危险化学制品等的定量中有重要的用途。在某些情况下，被测定的物质的量是如此之少—在毫克/分升或更小的范围内，或如此之难于精确地测定，以致使得所用的设备很复杂而且只有熟练的实验人员方可使用。在此情况下，在取样后一般不能在几小时或几天中得到结果。在其它的情况下，常强调非专业人员能在实验室外常规地、快速地并可重现地进行实验且配有快速或直接信息显示。有一种常用的医疗试验是测量糖尿病病人的血糖含量。现行的作法是建议糖尿病病人根据其具体症状的特点和严重程度，每天测自已的血糖含量2-7次。基于这种观察所测的血葡萄糖含量的模式，病人和内科医生一起作饮食、锻炼和胰岛素输入方面的调整，以便更好地控制这种疾病。很明显，应使病人立即得到这种信息。很多血糖测试方法和测试用品在本
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中是已知的；但它们都受到各种各样的限制。在R，Philips等人申请的，并作为该申请的同一授权人被授权的美国专利US,4,935,346，5,049,487，5,059,394和5,179,005中公开了一种重大的改进，并对之提出的权利要求。在这些专利中公开的和提出权利要求的方法涉及到从浸有一种试剂的惰性多孔基质的表面上读取反射读数，该试剂在将被分析的流体涂于另一表面时则将与该分析物相互反应，结果产生一种吸收光的反应产物，然后径此基体迁移至被读取的表面上。该试剂包括葡糖氧化酶，它消耗该试样中的葡萄糖而产生过氧化氢，在存有另一种酶，辣根过氧化酶时将包括3-甲基-2-苯并噻唑啉酮氢氯化腙(MBTH)及3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)的偶合染料氧化而产生一种蓝色的染料。然后以两个不同时的波长进行反光度测量。用LED分光光度计根据该染料颜色的强度确定血液中葡萄糖的浓度。在我们的待批的，于1994年5月19日申请的，共同转让的U.S.S.N.245，940(LFS30)中公开了一种包括游离形式或酸的形式的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和酸或盐的形式的8-苯胺基-1-萘磺酸盐(ANS)，它们将用于取代上述的MBTH-DMAB偶合染料。该MBTH-ANS偶合染料在氧化时是很难溶的。因此，与氧化的MBTH-DMAB偶合染料相比，它可以最低的染料退色而产生较稳定的终点。虽然这些现有的系统已被有效地用于生产对测定葡萄糖的存在或含量是有效的测试装置，但仍注意到某些缺点。其中将用这种偶合染料的测试装置被设计成家用型和专业用型两种，而当其由制造商和分销商出售时，由于希望将其长期保留在用户的清单中，所以当然必须在这段时间内保持有效。这种对具体的适用期的要求在采用MBTH作偶合染料中的一种组份的产品配制方面已引起了一些困难。首先，已发现，MBTH的稳定性随温度和碱度的上升而下降。游离酸形式的MBTH是很活泼的，而且趋于升华。在试图抵销这种作用方面，MBTH的酸性水合物，即3-甲基-2-苯并噻唑啉酮氢氯化腙是较合适的形式。遗憾的是，这种水合物在升温时本身是不稳定的，而且易因加热而分解成游离的MBTH和HCl。除了在高pH值时稳定性低之外，MBTH对于与其偶合的配偶体的氧化性反应的效力随着碱度的升高而下降，从而在高pH值时基本没有，或根本没有从该偶合染料中产生的颜色。鉴于这些关系，在实践中MBTH必须以大的超量及在低的pH下使用，以便将不稳定性和无效性的影响减至最小。在理论上说，从该化合物低升华和高效率的观点看，低于2.0的pH将是可取的。遗憾的是，这种理想的低pH不能用于本文所虑及的系统。如上所述，所用的该试剂系统取决于作用于被酶作用物分析物，并以表征被测样品中存有的该分析物量的量产生氧化剂的各种酶。就MBTH试剂为理想的这种低pH对诸如葡糖氧化酶和辣根过氧化酶之类的酶而言是全然不适宜的。在这种低pH下，这类市售的酶中的大多数几乎没有，或根本没有活性。因此，一直迫使这种技术包含及选择适度的pH，如，4及大为过量的试剂以保证其测试装置在规定贮存期中的功效。按本发明的说明，在含有酶的测试装置中提供了偶合染料中的高稳定的组分。与现有技术中所用的那些不同，该组分能在与高的酶效率匹配的相当高的pH条件下与种类广泛的偶合与偶体进行有效的氧化偶合。本发明的该偶合染料，更确切地说，是欲用于含有用来检测样品中的分析物的存在或数量的试剂体系的检测装置中的，其中该试剂系统包含一种或几种酶，该酶在存有该分析物时以表征试样中该分析物量的量产生一种氧化剂。根据本文中的说明，该试剂系统还含有能通过所产生的氧化剂的氧化而形成一种生色团的偶合染料，该偶合染料所包含的化合物为其中R选自由烷基，被取代的烷基，芳基，被取代的芳基，杂环，季胺或有机酸的部分所构成的物组，而Y选自由NO2、SO-3，H、卤化物、烷基或SiZ3所构成的物组，其中的Z或是烷基或是芳基。优选Y为H。在一优选实施方案中，R为其中任何的R1、R2、R3和R4独立地选自由H，烷基、芳基、甲硅烷基、卤化物、氢氧化物、硫醇盐、醇盐、硫代醇盐、胺、磺酸盐或羧酸盐构成的物组；而X选自由胺、磺酸盐或羧酸盐所构成的物组。在一特定的实施方案中，该检测装置来测定分析物，如葡萄糖、胆甾醇、乙醇、尿酸、甲醛、丙三醇-3-磷酸酯之类的全部通常所测的血液分析物的存在或数量。在这种情况下，这种酶的系统将包含与过氧化酶或具有类似于过氧化酶活性的无机配合物，如羟高铁血红素、氯化血红素及四(磺苯基)卟啉锰一起的，选自由葡糖氧化酶、胆甾醇氧化物、乙醇氧化酶、尿酸酶、乙醛氧化酶和甘油磷酸酯氧化物所构成的物组中的酶。所选的过氧化酶是辣根过氧化酶。图1是包含反应片的检测装置的一种实施方案的透视图，该被分析液态的试样是涂在该片上的；图2是应用图1中的检测装置的第二实施方案的透视图。如上所述，本发明涉及一种用于测定液态试样中的分析物的存在或数量的检测装置中的改进了的偶合染料化合物。参见图1，在本发明的一优选实施方案中，该检测装置包含一多孔的基片10，其中具有掺入的化学试剂系统，而且该基片粘结在支撑体12上。穿过该支撑体设有小孔16，借此可使液态试样被涂于基片10的试样接收表面17上。设置此化学系统为的是与存在于该液态试样中的任何的分析物反应，从而在该基片10所具有的检测表面19中显现出表征存在于该液体试样中的分析物数量的光反射性的结果。该检测表面可用肉眼阅读，但优选的是用光谱照像底片装置读出。这种装置的部件在图1中被示意性地示出，它们包括光源18，如最好是将波长均一的光导向该检测表面19的发光二极管。此外，还设有检测来自表面19的反射光并产生表征被测光的量的信号22的光检测器20，该信号比如，可用装在该阅读设备中的微处理机处理，以便算出该试样中的分析物的数量。诸如上述的系统在本
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中现在是已知的，而且在美国专利4,935,346、5,049,487、5,059,394和5,179,005中被充分地说明。这类系统准备用于这些检测装置，并将被插入解读设备中，然后将试样，比如血，涂在该样品接受表面上17。图2展示了这种系统的替代方案，其中首先将血涂在试样接收表面17上，然后仅将检测表面19向该解读设备显露。在其它的所有方面，图2中的编了号的部件与图1中的该类部件同。该检测表面的反射性通过该液体试样中的分析物与该多孔基片中存有的化学试剂间的一系列化学反应的运作而随样品中该分析物的量而变。尤其是该基片中包括一种或几种酶，该酶与分析物一取代物—起导致了过氧化氢或其它强氧化剂的产生。在该基片中包括一种偶合染料，即两种能被氧化而形成生色团的化合物，该生色团与存在的该生色团的量成比例地吸收特定波长的光。然后这种因酶催化反应而形成的氧化剂与该染料试样反应，结果产生该生色团。导致氧化剂的酶的选择及偶合染料的选择在本领域中是广为变化的，而且很大程度上随被测分析物而变化。比如，在测定血样中的胆甾醇的情况下，可采用氧化酶，如胆甾醇氧化酶。类似地，测定甲醇或乙醇可用醇过氧化酶；测定甲醛可用乙醛氧化酶，或则定丙三醇-3-磷酸酯可用甘油磷酸酯氧化酶。这些酶催化反应的过氧化氢产物可通过后续的酶催化反应而改变，结果产生与偶合染料反应而形成该生色团的活性的氧化剂。因此，比如，形成活性氧化剂的这种过氧化氢反应可被辣根过氧化酶催化。因而，虽然将可理解的是，本发明的说明是可广泛适用的，但为了进行下面的讨论，将以全血液体试样中的葡萄糖作为该分析物的例子。然后将以作用于该葡糖酶作用物而形成过氧化氢的葡糖过氧化酶作优选的化学系统的例子。而过氧化氢又通过另一种酶，辣根过氧化酶的反应而转变为活性的氧化剂。迄今为止，广泛用于上述种类的葡萄糖诊断检测中的偶合染料是3-甲基-2-苯并噻唑啉酮氢氯化腙。氢氯化物水合物(MBTH氢氯化物水合物)(式I)与二甲基氨基苯(式II)。这些化合物下列的氧化反应，结果形成染成蓝色的生色团(式III)＝过氧化氢/辣板过氧化酶(III)如上所述，这种系统有一些缺点。这种MBTH，即使是处于氢氯化物水合物的形式，在热和碱性的作用下也是相当不稳定的。此外，上述反应在高酸性的条件下，如pH为2或更低时是最为有效的。但遗憾的是，在这些条件下，用于该检测装置中的酶，如萄糖氧化酶和辣根过氧化酶却几乎没有或根本没有活性。因此，工业实践一直规定为得到相当稳定的系统，采用最优的pH，比如约4；以及用大量的酶和该偶合染料，以便补偿该酶活度的下降及该偶合反应的氧化功率的降低。按照本发明，现已发现可提供克服了迄今为止所碰到的稳定性问题的可提供MBTH的改性形式。此外，它们在一种有助于用于本发明所涉及的检测中的酶活性的环境中，如在范围为约4-约7的pH值的环境中是高度反应性的。此外，已发现某优选的衍生物是与该所需要的偶合配偶体一芳香胺是有高度反应性的。本发明的这些衍生物有如下的式IV中所示的一般结构其中R选自由烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基、杂环、季胺或有机酸部分所构成的物组，而Y选自由NO2、SO-3，H，卤化物，烷基或SiZ3所构成的物组，其中Z是烷基或芳基。优选Y为H。在一优选的实施方案中R为其中任何R1、R2、R3和R4独立地选自由H、烷基、芳基、甲硅基、卤化物、氢氧化物、硫醇盐、醇盐、硫代醇盐、胺、磺酸盐或羧酸盐组成的物组；而X选自由胺，磺酸盐或羧酸盐组成的物组。本发明的MBTH衍生物可与宽范围的偶合染料配偶体，如芳香胺，酚，被取代的酚进行氧化反应。此外，这类反应可在室温下，和在自4-11间变化的pH值下有效地进行。以本发明的这种衍生物的优选形式，该氧化反应在约4-约7的pH时是最为适宜的，因此，与诊断化学所感兴趣的胺偶合染料配偶体，如3-二甲基氨苯甲酸和8-苯胺基-1-萘磺酸酯一起是尤为有用的。不同于MBTH，这些衍生物，无论是处于游离酸，还是酸的水合物的形式，即使在100℃加热长达16小时时仍是相当稳定的。此外，在这种氧化反应的条件下，该过氧化物催化酶，如辣根过氧化酶，和使该氧化偶合反应逆转时是尤为有效的。实施例1-合成MBTH衍生物合成间[3-甲基2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸一钠(2]合成方案原料自Wiscosin的Milwaukee的AldrichCompany购买3-甲基2-苯并噻唑啉酮腙氢氯化物(MBTH·HCl)，NaI，氢氧化四丁基铵，二氯甲烷及n-甲基-2-吡咯烷酮，然后不经提纯就使用。三乙胺产自BakerChemicals，并由Phillipsburg(NewJersey)的BaxterCompany分销。从NewYork的FlukaChemicalsofRonkonkoma或NewHampshire的LancasterChemicalsofWindham购得1，3-二磺酰氯苯。[1]的合成将4克MBTH·HCl试样加在150ml的装有磁搅拌棒的Erlenmyer烧瓶中，再加50ml的n-甲基-2-吡咯烷酮和5ml三乙胺。用橡胶隔膜将此烧瓶盖住，然后将其置于一个磁力搅拌加热盘上。将该混合物加热至60-70℃，同时激烈搅动0.5小时，结果产生一种黄色的浆体。将此烧瓶置于水浴中以便冷却。将5克1，3-二磺酰氯苯试样加于装有磁搅拌棒的250mlErlenmeyer烧瓶中。将该烧瓶降入水浴中，再加20ml的n-甲基-2-吡咯烷酮。搅动此混合物直到该固体溶解为止(约15分钟)。将这种预先得到的MBTH无碱浆体缓慢地倒入该溶液中。使所得的该浅黄色的混合物于冰浴温度下反应1.5小时。此后用10ml的2NHCl将该反应止。再于室温将其再搅动30分钟。将50毫克12目的Norti(活性碳中珠)加于此溶液中，搅10分钟后吸出浅黄色的溶液。然后借助吸气器径细等级的玻璃料将其过滤。得到黄至浅棕色的平静的溶液。将300ml2NHCl加于此搅拌中的黄溶液，结果沉淀出灰白色的粉末。用真空过滤收集此固体，再用25ml去离子水将该产生洗3次。通过110℃的2小时的真空干燥，得到5.6克的此灰白色产物。用1HNMR和HPLC分析此产物，其纯度为97％。化合物[1]在大多数常用有机溶剂和水中不易溶解。但它可溶于碱性溶液和极性溶液，如DMSO，NMP和DMF中。合成[2]将2.0克粗[1]悬浮于50ml二氯甲烷中。在2分钟的过程中，将4ml1M的四丁基氢氧化铵缓慢加于此搅拌着的悬浮液中；然后吸出淡黄色的溶液。用10ml去离子水洗此溶液，再于无水硫酸钠上将其干燥。用重力过滤去除该硫酸盐，然后用旋转蒸发器蒸发该所得的混合物至干燥。收集到一种深黄色的油。用125ml丙酮提收取此油，再于5分钟的过程中加10ml20％的溶于丙酮中的NaI。出现白色沉淀物。使此混合物再反应20分钟，然后借助真空过滤径细等级玻璃料收集此沉淀物。用20ml丙酮洗此所得的灰白色固体3次。通过110℃，45分钟的干燥，得到1.3克(65％)的合乎需要的产物。化合物[2]易溶于水和水-乙醇混合物中。该固体在空气和光中是稳定的，但其溶液长时间地悬露于光时却缓慢地分解为浅黄色的雾状混合物。实施例2制备测试装置将一片聚合物膜(反应基片)浸在表1中的水溶液中，直至饱和。将其从该溶液中取出。再用玻璃棒将多余的试剂刮掉。然后将该片挂在56℃的空气循环烘炉中经5-10分钟以便干燥，此后取出该片，再将其浸入表1中所述的有机溶液中直至饱和。再将其如前一步骤那样干燥。将得到的片作成合乎检测要求的形状。表1一配制试剂</tables>实施例3-测定葡萄糖将含葡萄糖的血样涂到渗有该试剂的片上。该试样立即被吸收入该基片中，然后出现蓝色。颜色的强度被随时间而增强，并与分析物的浓度成正比。在此颜色强度的基础上，通过与标准化的曲线对比而测定该葡萄糖的浓度。类似地，过氧化氢含水溶液(有机过氧化物，三价铁和醌的)也在浸渍有该试剂的片上产生蓝色。可用同于上述的方法测定该分析物的浓度。现已对本发明作了充分的陈述，对于本领域中的普通技术人员而言将明了的是，不违背本发明的精神和范围还可作出多种改型和变更。权利要求1.在含有试剂系统的，用于检测试样中的分析物的存在或数量的检测装置中，其中所述的试剂系统包含产生表征所述试样中的所述分析物数量的数量氧化剂的酶；其中的改进为所述的试剂系统包含在被所述氧化剂氧化时形成生色团的偶合染料，所述的偶合染料包含下式的化合物其中R选自由烷基，取代的烷基、芳基、取代的芳基、杂环、季胺或有机酸部分组成的物组，而Y选自由NO2、SO-3、H、卤化物、烷基或SiZ3组成的物组，其中Z是烷基或芳基。2.权利要求1的检测装置，其中R为其中任何的R1、R2、R3和R4独立地选自由H、烷基、芳基、甲硅烷基、卤化物、氢氧化物、硫醇盐、醇盐，硫代醇盐、胺、磺酸盐或羧酸盐构成的物组；而X选自由胺、磺酸盐或羧酸盐。3.权利要求2的检测装置，其中X为H。4.权利要求1的检测装置，其中所述的酶选自由葡糖氧化酶，胆甾醇氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸酶、乙醛氧化酶和甘油磷酸酯氧化酶组成的物组。5.权利要求4的检测装置，其中所述的酶还包含过氧化酶或有类似于过氧化酶性能的无机配合物。6.权利要求4的检测装置，其中所述的酶包括葡糖氧化酶和辣根过氧化酶。7.权利要求1的检测装置，其中所述的偶合染料还包括3-二甲基氨基苯甲酸。8.权利要求1的检测装置，其中所述的偶合染料还包括8-苯胺基-1-萘磺酸酯。9.权利要求1的检测装置，其中所述的化合物是间[3-甲基2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸一钠。全文摘要提供一种用于检测试样中的分析物的存在或数量的含试剂系统的检测装置中的偶合染料化合物。该试剂系统包括一种或多种酶，该酶在存有该分析物时产生其量表征该样品中的分析物量的氧化剂。所选的该化合物是间[3-甲基2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺酰基苯磺酸一钠。文档编号G01N33/533GK1162739SQ9612149公开日1997年10月22日申请日期1996年12月14日优先权日1995年12月15日发明者Y·S·玉申请人:生命扫描有限公司