一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术、生物医药、医疗器械以及环境与安全等领域。具体说来，本发明利用免标记、免微流控的一种易普及、高性能的二维光散射静态细胞仪实现对单细胞或者微粒的高精度分析，预期在生物医药以及环境与安全等领域有重要应用。
【背景技术】
[0002]众所周知，光学显微镜在细胞以及微粒分析方面具有广泛应用。对于常规光学显微镜，其放大倍数主要取决于所配置的物镜。一般说来，物镜可放大4，10，20，40，60以及100倍，而要实现高分辨率测量，比如亚微米以及纳米尺度测量，通常需要使用较大倍数的光学物镜，但较大的放大倍数又会限制该物镜相应的工作距离以及视场面积，造成聚焦操作以及样本观测等方面的局限性。而且，由于光学衍射极限的限制，常规光学显微镜的最高分辨率约为300纳米。近年研宄开发的近场光学显微镜以及随机光学重建显微镜，可实现数十纳米精度的光学分辨率，但其与常规光学显微镜存在很大差别，且仪器价格昂贵、操作复杂，一定程度了限制了该类技术的推广与应用。
[0003]流式细胞术利用激光光束激发处于流动状态中的单列细胞或微粒，然后对其散射光或荧光进行探测，可实现单细胞或微粒的逐个、多参数、快速定性以及定量分析。已知散射光不依赖于细胞样品的制备技术，可反映细胞的物理参数；前向小角度的光散射信号(forward scatter, FSC)能够反映细胞体积的大小，而侧向90°方向的光散射信号(sidescatter, SSC)对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，反映了细胞内精细结构和颗粒性质的信息。流式细胞仪主要由四大模块组成:流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统；具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。细胞仪操作过程中，需将待测细胞经特殊染料进行荧光染色并制成细胞悬液，之后在液流压力的作用下从样品管射出，同时鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周，从而使细胞悬液在鞘液流的包裹下形成单行排列，且依次通过流动室的检测区域。另外，以激光作为激发光源，使其垂直照射在检测区域的样品流上，当携带荧光素的细胞与激光正交时，就产生了散射光和激发荧光，它们同时被前向探测器和侧向90°方向的探测器接收。这些光信号转化成电信号，由放大器放大后，被传送到计算机，经A/D转换器传输到微机处理器形成数据文件，然后进行相应的数据处理和分析，最终达到对细胞分类识别的目的。
[0004]若要完成细胞分选，需事先选定某个参数，用于判断该细胞是否被分选:由喷嘴射出的液柱在压电晶体几十千赫兹的电信号作用下发生振动而均匀断裂，形成了一连串的小水滴，根据选定的参数由逻辑电路判断是否将被分选，而后由充电电路对选定的细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，从而落入不同的收集容器中，完成细胞的分选。
[0005]以上方法与装置的问题在于:
[0006](I)由于衍射极限的限制，传统的光学显微镜用于细胞及微粒分析时的最高分辨率约在300nm，而此时其对物镜的数值孔径有较高的要求，如需使用100倍的油浸式物镜；
[0007](2)传统的细胞分析装置如流式细胞仪，通过前向散射光信息来分析细胞尺寸，但存在其分析精度低、不能明确的识别细胞尺寸的问题；
[0008](3)由于流式细胞仪的激发光路是固定的，一般与细胞悬液的轴心正交，这就要求细胞必须在流经激光聚焦区时不能偏离其轴心，且不能聚集成团、阻塞管路，否则光束无法准确照射细胞中心，造成信号不稳定，影响测量结果的准确性。这需要复杂、昂贵的流体控制技术，如水动力聚焦技术，不太适用于大部分的实验室；
[0009](4)使用不同孔径的喷孔及改变液流速度都会影响细胞分析和分选效果，并且从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，延迟时间的精确测定也是影响分选质量的关键，这造成了流式细胞仪操作使用的复杂性；
[0010](5)传统扫描流式细胞仪只测量方位角一维光散射，由于存在细胞形状任意性和细胞轴向问题，在固定角度得到的一维散射光谱会丢失很多信息；
[0011](6)流式细胞仪检测需要对被测细胞进行特殊染料的荧光染色或标记，这些标记会对细胞产生一定的损伤，影响细胞活性；
[0012](7)传统流式细胞仪的电磁场细胞分选对生物活体会产生一定影响。
[0013]折射率是一个表征物质光学性质的基本物理量，对其进行测量对于我们理解生物细胞等的光学性质具有重要意义。目前通常利用折射率定律进行折射率的测量，即折射角的正弦与入射角的正弦之比等于入射光所在介质的折射率与折射光所在介质的折射率之比，主要方法包括精密测角仪法、V棱镜折射仪法、阿贝折射仪法和浸液法。这些测量方法通常需要复杂的光路系统，且对被测样品的大小及形状有较高的要求，这在一定程度上限制了其应用，特别是在细胞及微粒折射率测量上的应用。
[0014]总之，现有的细胞仪器存在一定的局限性，亟需一种新型的二维光散射静态细胞仪方法及装置。
【发明内容】
[0015]为解决现有技术存在的不足，本发明公开了一种新型二维光散射静态细胞仪方法及装置，可实现对细胞以及微粒的高精度分析，达到亚微米以及纳米精度，以及进行折射率的测量。该发明具备操作简单、易普及等特性，具有重要的实际应用价值。
[0016]为实现上述目的，本发明的具体方案如下:
[0017]一种新型二维光散射静态细胞仪装置，包括激光光源，所述激光光源依次与中性密度滤光片及光学透镜及光纤耦合系统相连，光学透镜及光纤耦合系统调整激光，使光纤作为激发静态细胞样品安放装置上静态细胞的探针，静态细胞样品安放装置与二维光散射图样探测记录系统相连，二维光散射图样探测记录系统记录被测细胞的二维光散射图样并将该图样传送至分析系统。
[0018]所述光学透镜及光纤耦合系统包括第一物镜，第一物镜与光纤耦合器相连，所述光纤耦合器与第一三维位移台相连，所述第一三维位移台通过光纤与第二三维位移台相连。
[0019]所述激光光源发出的光依次穿过中性密度滤光片及第一物镜。
[0020]所述静态细胞样品安放装置，用于固定被测细胞样品，形成单细胞薄层，包括两片载玻片、两片盖玻片和显微镜三维载物台，其中一个载玻片两端分别放置一片盖玻片，中间滴入样品，之后在上面盖上另一片载玻片，构成微通道，控制好样本单细胞浓度，形成单细胞薄层。
[0021]所述二维光散射图样探测记录系统，用于记录被测细胞的二维光散射图样，包括第二物镜和CMOS探测器，通过第二物镜监测光纤探针的移动，移动光纤探针定位芯片中的细胞，保证激光垂直照射细胞，被测细胞被激光激发，形成分布于三维空间的散射光，散射光经过第二物镜后，被CMOS探测器探测并收集。
[0022]所述激光光源采用二极管泵浦固体激光器，用于提供静态细胞样品安放装置上静态细胞的激发光源。
[0023]所述光纤为直径125um、数值孔径0.22的光纤。
[0024]所述激光光源产生的直径为1.0mm的激光光束。
[0025]第一物镜:数值孔径为0.1的四倍物镜。第二物镜:数值孔径为0.25的十倍物镜。
[0026]一种新型二维光散射静态细胞仪方法，包括