一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统及方法
【专利摘要】本发明公开了一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统，是基于共轴迈克尔孙干涉光路和米劳干涉装置，样品位于载物台上，载物台为一半透半反镜，反射光束通过米劳干涉装置在迈克尔孙干涉光路上产生干涉，由显微镜得到放大的干涉图像，从图像可以提取样品的相位信息。同时，通过样品的前向透射光束经过半透半反镜面后，产生前向小角和大角散射，该散射图像可由前向CCD接收，从中可获取前向散射幅值分布，由散射理论可以解构样品的大小。本发明装置通过集成相位和散射信息可更加准确地检测样品的形态结构，在透明物体显微形态测量方面具有重要的实用价值，特别是在生物细胞亚结构形态的检测应用领域。
【专利说明】一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物细胞原态显微成像【技术领域】，具体涉及一种综合接收和分析干涉 信息和散射信息的显微成像系统。
【背景技术】
[0002] 大部分细胞虽然常常被认为是无色透明的，但是从严格意义上讲，不可能是完全 透明的，即不可能是纯相位物体，因此当光透过细胞后，光的振幅和相位都会发生改变，透 过细胞的光的振幅和相位都包含了细胞的信息。相位成像检测技术从细胞对入射光波的相 位调制量中去获取细胞的信息，而光散射检测技术则是从细胞对入射光的振幅调制量入手 得到细胞的信息。因此从理论上说，相位成像检测技术与光散射检测技术研究的是透过细 胞的光信息的两个方面，既相互独立又相互联系，互为补充。
[0003] 现有的大部分相位成像检测技术都是基于干涉法，可实现物体的全场成像，不仅 其横向空间分辨率高，一般只受衍射极限的限制，而且其轴向分辨率高，可达亚波长量级， 适用于无散射物体或弱散射物体的检测。根据两干涉光（物光波和参考光波）在记录平 面是否存在夹角，可以分为同轴式和离轴式。典型的同轴定量相位成像技术包括Gabriel Popescu教授研究小组2004年提出并发展起来的傅立叶相位显微技术（FPM)，由杜克大学 Adam Wax教授研究小组提出的平行同轴全息相位显微术，等等，同轴定量相位成像技术具 有较好的稳定性，能够抑制一定的相位噪声，但是一般需要多次测量；典型的离轴定量成像 技术包括希尔伯特相位显微术（HPM)，衍射相位显微术（DPM)，两步相移双通道干涉等等， 此类成像技术成像速度快，但是需要大的CCD空间宽带。近年来，Adam Wax教授提出了轻 微离轴干涉（Slightly Off-Axis Interference),此技术介于离轴干涉与同轴干涉之间， 相比离轴干涉需要更小的CCD空间宽带，相比同轴干涉需要更少的测量，优化了空间分辨 率。2006年Gabriel Popescu教授研究小组提出衍射相位显微术（DPM)，它结合了离轴光 路和共轴光路的优点：具有较好的稳定性和高的采集速率，但是由于光源的原因，衍射相 位显微技术（DPM)的图像存在散斑，这将会降低空间相位的敏感度，并限制了其在细胞亚 结构研究中的应用，2011年同样是由Gabriel Popescu教授研究小组提出空间光干涉技 术（SLIM)采用白光作为光源克服了散斑效应，但是此技术需要为每个定量相位图采集四 幅强度图像。之后，2012年Gabriel Popescu研究小组提出用白光作光源的衍射相位显 微技术（wDPM)，以及其 2014 年发表的专利技术 US 2014/0085715A1 (Diffraction phase microscopy with white light:白光光源的衍射相位显微技术）实现了单次拍摄以及高的 时间和空间上的灵敏性。但是以上提及的技术都是获取样品的干涉信息，仅仅可检测透明 相位体样品，对样品的亚结构尚存在检测困难。
[0004] 光散射检测技术一般不需要干涉，直接测量的是散射强度分布、散射能量分布或 光强的衰减等，它提供的信息是测量体积内的平均值，平均化了单个成分对散射的贡献，样 品亚结构形态对其散射影响较大，所以在细胞大小测量方面有着重要的应用，如专利技术 W0 2014/084957 A1 (Optical system, apparatus and method for flow-cytometry:流式 细胞仪的光学系统，装置和方法），但是，此类技术对于细胞形态变化的定量测量，只是从散 射方面分析，不涉及干涉信息。
[0005] 本发明主要针对上述两类技术存在的不足，发明了可同时接收样品光散射和相位 显微信息的装置，应用该装置可根据不同模型和算法计算，最终可得到高精确度的细胞亚 结构形态结果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统及方法， 使之能够综合分析物体的干涉信息和散射信息，更加精确地获得物体的亚结构形态。
[0007] 为了解决以上技术问题，本发明采用的具体技术方案如下： 一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统，其特征在于包括：共轴迈克尔孙干 涉光路和米劳干涉装置，具体为： 所述的米劳干涉装置由第三透镜（7)、反光镜（8)、第二分光镜（9)组成；经过所述米 劳干涉装置的图像经显微镜（14)放大后，由干涉图像接收器即(XD-2 (16)接收为数字相位 图像并由计算机（17)进行数值计算和处理； 所述的迈克尔孙干涉光路由光源（1)、第一分光镜（6)、反光镜（8)、第二分光镜（9)、载 物台（10)组成；还包括由第四透镜（11)和第五透镜（12)组成的透镜扩束准直系统、散射 强度接收器即CCD-1 (13)、干涉图像接收器即CCD-2 (16)、显微镜（14)、第六透镜（15)、用于 对散射信息和相位信息进行采集存储和处理的计算机（17); 所述载物台（10)为一个角度可调的半透半反镜，与反光镜（8)夹角可调，可实现同轴、 离轴和轻微离轴干涉的光路调节； 所述的载物台（10)是半透半反镜，以保证经过样品的散射光可以透过载物台向下传 输； 第一分光镜（6)与水平面成45度夹角；第二分光镜（9)的摆放位置保证使载物台（10) 的反射光与反光镜（8)的反射光所经过的路程相等；反光镜（8)放在第三透镜（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保证发生反射的基础上越小越好。
[0008] 根据所述的一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统的显微成像方法，其 特征在于包括以下步骤： 步骤一，使光源（1)的光束经由第一透镜（2)、视场光阑（3)、第二透镜（4)、孔径光阑 (5)组成的光束整形系统后，传输至第一分光镜（6);所述第一分光镜（6)的反射光通过第 三透镜（7)传输到第二分光镜（9)，光束由第二分光镜（9)分成两部分：一部分反射到反光 镜（8)上，一部分透射到样品上；透射到样品上的光束经载物台（10)时，一部分发生反射得 反射光，所述反射光再次通过样品之后和反光镜（8)的反射光相遇产生干涉，先后经第三 透镜（7)、第一分光镜（6)、显微镜（14)和第六透镜（15)，在CCD-2 (16)上形成显微干涉图 像；所述显微干涉图像经计算机（17)处理后得到反映样品形态结构的相位分布信息； 步骤二，利用第二分光镜（9)透射到样品上的光经载物台（10)时一部分光透过载物台 (10)得透射光；所述透射光即包含样品的散射信息，经第四透镜（11)、第五透镜（12)组成 的透镜扩束准直系统，所述散射信息由CCD-1 (13)接收为数字图像并由计算机（17)进行数 值计算得散射强度并处理得反映样品大小的散射幅值分布信息； 步骤三，计算机（17)对所述步骤一得到的干涉信息和步骤二得到的散射信息，基于散 射理论和相位成像理论开展计算，最终可获得相位体样品形态、结构和大小信息。
[0009] 本发明的工作原理如下： 由光源1发出的光束，向前传输经由第一透镜2、视场光阑3、第二透镜4、孔径光阑5 组成的光束整形系统后，传输至第一分光镜6,所述第一分光镜6的反射光继续向下传播， 经第三透镜7传输至第二分光镜9,所述第二分光镜9将光束分为两部分，一部分反射到反 光镜8上，一部分透射到样品上：透射到样品上的光一部分发生反射，这部分反射光和反光 镜8的反射光在第二分光镜9处相遇并发生干涉，之后经第三透镜7、第一分光镜6、显微镜 14、第六透镜15,由（XD-2 16接收显微干涉图样；透射到样品上的光还有一部分透过半透 半反镜的载物台，经第四透镜11、第五透镜12组成的透镜扩束准直系统，由（XD-1 13收集 样品散射强度信息。最后计算机17对得到的干涉信息和散射信息，基于散射理论和相位成 像理论开展计算，最终可获得高精确度的相位体样品形态、结构和大小信息。
[0010] 本发明具有有益效果。本发明光源采用低相干白光源，提高分辨率，减少噪声；本 发明采用共轴迈克尔孙干涉光路，提高了实验的稳定性；本发明载物台为一角度可调的半 透半反镜，能保证包含样品散射信息的散射光可以透过载物台继续传输，并且与反光镜角 度可调，可实现同轴、离轴和轻微离轴干涉的光路调节。本发利用CCD-1 13采集样品散射 强度、CCD-2 16接收显微干涉图像，使计算机可以综合分析散射信息和干涉信息，得到具有 高精确度的相位体样品形态、结构和大小信息；本发明的显微物镜位于干涉系统之后，可减 少相位噪声。因此，本发明系统应用面广，具有很强的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统对应的光路示意图。
[0012] 图中：1.光源；2.第一透镜；3.视场光阑；4.第二透镜；5.孔径光阑；6.第一分 光镜；7.第三透镜；8.反光镜；9.第二分光镜；10.载物台；11.第四透镜；12.第五透镜； 13. CCD-1 ;14.显微镜；15.第六透镜；16. CCD-2 ;17.计算机。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图，对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0014] 本发明的集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统，是通过共轴迈克尔孙光路 和米劳干涉仪实现的，如图1所示。
[0015] 由光源1发出的光束，向前传输经第一透镜2、视场光阑3、第二透镜4、孔径光阑 5组成的光束整形系统，到达第一分光镜6,所述第一分光镜6的反射光经第三透镜7传输 至第二反光镜9,光束由第二分光镜9分成两部分，一部分反射到反光镜8上，一部分透射 到样品上：透射到样品上的光一部分发生反射，这部分反射光和反光镜8的反射光在第二 分光镜9处相遇并发生干涉，之后经第三透镜7、第一分光镜6、显微镜14、第六透镜15,由 CCD-2 16接收显微干涉图像，并存储在计算机17中；透射到样品上的光还有部分透过半透 半反镜的载物台10继续向下传输，经第四透镜11、第五透镜12组成的透镜扩束准直系统， 在CCD-1 13上采集散射强度，并存储在计算机17中。最后计算机17根据得到的样品显微 干涉图像和散射强度信息，基于散射理论和相位成像理论开展计算，最终可获得相位体样
【权利要求】
1. 一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统，其特征在于包括：共轴迈克尔孙 干涉光路和米劳干涉装置，具体为： 所述的米劳干涉装置由第三透镜（7)、反光镜（8)、第二分光镜（9)组成；经过所述米劳 干涉装置的图像经显微镜（14)放大后，由干涉图像接收器即(XD-2 (16)接收为数字相位图 像并由计算机（17)进行数值计算和处理； 所述的迈克尔孙干涉光路由光源（1)、第一分光镜（6)、反光镜（8)、第二分光镜（9)、载 物台（10)组成；还包括由第四透镜（11)和第五透镜（12)组成的透镜扩束准直系统、散射 强度接收器即CCD-1 (13)、干涉图像接收器即CCD-2 (16)、显微镜（14)、第六透镜（15)、用于 对散射信息和相位信息进行采集存储和处理的计算机（17); 所述载物台（10)为一个角度可调的半透半反镜，与反光镜（8)夹角可调，可实现同轴、 离轴和轻微离轴干涉的光路调节； 所述的载物台（10)是半透半反镜，以保证经过样品的散射光可以透过载物台向下传 输； 第一分光镜（6)与水平面成45度夹角；第二分光镜（9)的摆放位置保证使载物台（10) 的反射光与反光镜（8)的反射光所经过的路程相等；反光镜（8)放在第三透镜（7)下面的 中心位置，其尺寸在能保证发生反射的基础上越小越好。
2. 根据权利要求所述的一种集成光干涉和散射信息分析的显微成像系统的显微成像 方法，其特征在于包括以下步骤： 步骤一，使光源（1)的光束经由第一透镜（2)、视场光阑（3)、第二透镜（4)、孔径光阑 (5)组成的光束整形系统后，传输至第一分光镜（6);所述第一分光镜（6)的反射光通过第 三透镜（7)传输到第二分光镜（9)，光束由第二分光镜（9)分成两部分：一部分反射到反光 镜（8)上，一部分透射到样品上；透射到样品上的光束经载物台（10)时，一部分发生反射得 反射光，所述反射光再次通过样品之后和反光镜（8)的反射光相遇产生干涉，先后经第三 透镜（7)、第一分光镜（6)、显微镜（14)和第六透镜（15)，在CCD-2 (16)上形成显微干涉图 像；所述显微干涉图像经计算机（17)处理后得到反映样品形态结构的相位分布信息； 步骤二，利用第二分光镜（9)透射到样品上的光经载物台（10)时一部分光透过载物台 (10)得透射光；所述透射光即包含样品的散射信息，经第四透镜（11)、第五透镜（12)组成 的透镜扩束准直系统，所述散射信息由CCD-1 (13)接收为数字图像并由计算机（17)进行数 值计算得散射强度并处理得反映样品大小的散射幅值分布信息； 步骤三，计算机（17)对所述步骤一得到的干涉信息和步骤二得到的散射信息，基于散 射理论和相位成像理论开展计算，最终可获得相位体样品形态、结构和大小信息。
【文档编号】G01N21/45GK104122228SQ201410331575
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】季颖, 梁敏捷, 王亚伟, 徐媛媛 申请人:江苏大学