基于数字微镜器件的快速精准光学聚焦增强方法与系统与流程

本发明属于光遗传学与光学显微成像领域，特别涉及了一种基于数字微镜器件的快速精准光学聚焦增强方法与系统，并应用于光遗传学光刺激与光学显微成像。

背景技术：

在生物医学光学领域，光学散射是制约光学成像质量的主要因素。多数深部组织成像的光学技术(例如，激光共聚焦成像，双光子显微镜和光学相干层析扫描)主要利用非散射光子(即弹道光子)成像。弹道光子的数量随深度增加呈指数式衰减，因此将光束聚焦范围限制在了1mm的深度。

光遗传学技术需要对特定的神经元进行光刺激，以研究其神经环路机理。但是传统的光纤植入式光遗传学对活体生物的损伤严重，不利于长期研究。早先应用在天文学中的自适应光学技术，为实现深层生物组织光刺激与成像提供了新的技术支持。

现有的非侵入式自适应光遗传学技术是基于自适应光学的精确相位校正技术，或基于相干光自适应技术来进行相位补偿的。精确相位校正技术通过将空间光调制器分成若干分区，依次等间隔改变分区内的光束附加相位，探测其最佳光束聚焦相位。每个分区依次循环迭代，从而获得最终校正相位，对入射光束进行相位补偿，从而校正其畸变相位，形成良好光束聚焦。

但是以上精确相位校正需要消耗大量的时间，为了获得更好地光学校正，就需要划分更多的分区与更细的相位间隔。由于空间光调制器的图像刷新率较低，导致光学校正消耗大量时间。

相干光自适应技术也是将空间光调制器分成若干分区，利用分块可变形镜或数字微镜器件对入射到空间光调制器上的光束进行快速强度调制，从而利用各光束相干得到的光强值计算出不同分区对应的光束所需的补偿相位，然后再将相位加载到空间光调制器上进行光束补偿。

虽然利用相干光自适应技术能够有效地缩短校正光束相位的时间，但是依旧无法克服空间光调制器加载相位进行校正所消耗的时间，不利于活体生物中进行实时光遗传学刺激与研究，制约了自适应光遗传技术的推广。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的在于利用图像刷新率较高的数字微镜器件解决传统自适应光遗传学中空间光调制器耗时较长的问题。利用数字微镜器件快速的刷新率，从光学衍射原理出发，将光束分为若干区域，借鉴相干光自适应技术的快速补偿相位探测技术，通过区分不同相位对光束聚焦中心的干涉作用，将对聚焦中心干涉相长的区域保留，并去除对聚焦中心干涉相消的区域，从而提升了光束聚焦的质量，省去了利用空间光调制器加载补偿相位所消耗的时间，缩短了自适应光刺激的校正时间。

为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

一、一种基于数字微镜器件的快速精准光学聚焦增强方法：

1)物镜的焦平面处不放置实验样品，用无加载分区的数字微镜器件进行光束聚焦，在物镜的焦平面处得到理想聚焦光斑，记录理想聚焦光斑的聚焦中心位置of；

2)将实验样品置于物镜的焦平面处，用无加载分区的数字微镜器件进行光强探测，记录获得聚焦中心位置of的光强值；

3)将数字微镜器件的反射面分为多块区域，并将所有区域分为两个部分；

每个部分中的各个区域可以是相连通的，也可以是不连通，即棋盘格类似的等分方式。

4)针对每一部分的各个区域以强度调制方式进行光强探测，获得每一部分对应记录到的聚焦中心位置of处的一个光强值，并处理获得每一部分中各个区域对应的补偿相位值；

5)将每一区域的补偿相位值与π进行比较，并采用以下方式处理得到筛选结果：

若补偿相位值小于等于π，则该光强值对应的区域保留；

若补偿相位值大于π，则该光强值对应的区域去除；

6)将根据筛选结果调整分区并加载到数字微镜器件上进行光强探测，在实验样品内形成最终光学聚焦增强光斑，在聚焦中心位置为of处激发出更强的荧光。

所述步骤1)中的光束聚焦具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦。

所述步骤2)、4)和6)中的光强探测具体是：激光器发射出光束，经过准直扩束后，在数字微镜器件上反射，然后经过物镜聚焦到样品上，样品带有荧光材料，在样品内产生畸变散射光斑并激发出荧光，激发出的荧光再经透镜聚焦后由光电倍增管和振镜配合进行扫描探测获得散射光斑激发出的荧光图像，记录聚焦中心位置of的光强值。

所述的荧光材料包括荧光蛋白、荧光小球或者荧光染料。

所述实验样品为但不限于活体生物组织、离体生物组织、含小球的琼脂块等。

所述步骤3)中将数字微镜器件的反射面分为多块区域具体是指将数字微镜器件的微镜像素元以n×n方式均匀分区，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的n×n个光束单元。

所述步骤4)具体为：在光强探测时，保持第一部分内各个区域的反射面不变，将第二部分内各个区域的反射面同时以不同的频率进行来回偏转，不同区域具有不同的来回偏转的频率，由时间长持续不断地来回偏转形成对不同分区的光束进行不同频率的强度调制，对调制后的光束进行光强探测；将探测得到的光强值做傅里叶变换并绘制频率-幅值图，由频率-幅值图中不同区域的调制频率对应的光强幅值进行转换计算为补偿相位，从而得到第二部分内不同区域所需的补偿相位值。

反之处理，保持第二部分内各个区域的反射面不变，将第一部分内各个区域的反射面同时以不同的频率进行来回偏转，能计算得到第一部分内不同区域所需的补偿相位。

所述步骤4)具体是指将多个区域等分为无共同分区的两个部分，根据奈奎斯特采样定律选择每个部分合适的调制频率范围，并且设置每个部分中的每个分区有不同的强度调制频率，每个部分所有分区对应的强度调制频率能覆盖到该部分的调制频率范围。

然后在光强探测时，保持某一部分的区域的反射面不变，另一部分内的各区域的反射面同时以对应的不同频率进行振动，使得每个区域的反射面产生的光束以设置的频率在正侧光路与旁侧光路之间来回偏转，旁侧光路将光束阻挡，正侧光路为未进行强度调制前反射面产生光束的光路，从而对不同分区的光束进行不同频率的强度调制。

所述步骤6)根据筛选结果调整分区具体是：经过数字微镜器件时，筛选后去除的区域将自身接收入射光束后产生的反射光束调整反射角度，使反射光束到旁侧光路，同时筛选后保留的区域保持反射光束的反射角度与所述步骤2)光强探测时反射光束的反射角度相同。

二、一种基于数字微镜器件的快速精准光学聚焦增强系统：

系统包括激光器、光纤、准直透镜、数字微镜器件、光挡、缩束模块、扫描模块、二向色镜、显微物镜、实验样品和光强探测模块。光纤和准直透镜布置在激光器之后，激光器发射出光束经光纤传输之后通过准直透镜入射到数字微镜器件，数字微镜器件旁侧出射端置有光挡，数字微镜器件前侧出射端置有缩束模块，前方设有二向色镜；光束经二向色镜反射后经过扫描模块进入显微物镜聚焦，实验样品位于显微物镜焦平面上；实验样品内激发出的荧光经过显微物镜与扫描模块后透过二向色镜被光强探测模块接收进行光强探测。

所述的缩束模块包括前缩束模块透镜和后缩束模块透镜；前缩束模块透镜和后缩束模块透镜依次平行布置在数字微镜器件的正侧，数字微镜器件反射的光束依次经前缩束模块透镜和后缩束模块透镜平行缩束后入射到二向色镜的旁侧。

所述的扫描模块包括前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜；前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜依次布置在二向色镜的前侧，二向色镜反射的光束依次经前扫描振镜、前光束准直透镜、后光束准直透镜、后扫描振镜、前扫描模块透镜和后扫描模块透镜后入射到显微物镜。

所述的光强探测模块包括光学滤波器、准直聚焦透镜、光纤、聚焦透镜和光电倍增管；光学滤波器、准直聚焦透镜、光纤、聚焦透镜和光电倍增管依次布置在二向色的后侧，实验样品发出的荧光依次经显微物镜、后扫描模块透镜、前扫描模块透镜、后扫描振镜、后光束准直透镜、前光束准直透镜、前扫描振镜、二向色镜、光学滤波器、准直聚焦透镜、光纤和聚焦透镜后进入光电倍增管进行光强探测。

本发明的有益效果是：

本发明利用数字微镜器件实现了快速的自适应光束聚焦增强，利用数字微镜器件快速的图像刷新速率，克服了以往利用空间光调制器进行相位校正时速度慢的问题，提升了光束聚焦与光学刺激的速度。

本发明基于光学衍射成像原理，通过将数字微镜器件与相干光自适应技术结合，筛选出对聚焦光斑有干涉相消作用的分区光束并将其去除，从而使得聚焦中心的光强显著提升，提高了自适应光束聚焦质量。

本发明使用数字微镜器件进行自适应光束增强，取代了昂贵的空间光调制器，在保证光束聚焦的同时降低了实验成本，更利于方法与系统在研究实验中的应用。

并且本发明可方便地与已有的各种显微成像技术相结合，实现同步的光刺激与显微成像，有利于基于光遗传学对行为学与神经环路等面向大脑不同区域的研究发展。

附图说明

图1为本发明系统的结构示意图；

图2为实施例中无数字微镜器件筛选时的散射聚焦光斑图像；

图3为实施例中数字微镜器件第一部分分区所施加的调制频率示意图；

图4为实施例中数字微镜器件第二部分分区所施加的调制频率示意图；

图5为实施例中光电倍增管探测到的强度调制后的部分荧光光强值；

图6为实施例中荧光光强值作傅里叶变换之后的部分频率-幅值图；

图7为实施例中从荧光光强值中计算得到的部分分区补偿相位值；

图8为实施例中数字微镜器件第一部分分区所需补偿的分区分布图；

图9为实施例中数字微镜器件第二部分分区所需补偿的分区分布图；

图10为实施例中数字微镜器件所需去除的光束分区分布图；

图11为实施例中数字微镜器件加载筛选分区后的光束聚焦光斑图像。

具体实施方式

以下自适应光束聚焦增强实施例可以更详细的说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明的实施例及其具体过程如下：

如图1所示，本发明系统包括激光器1、光纤2、准直透镜3、数字微镜器件4、光挡5、前缩束模块透镜6、后缩束模块透镜7、二向色镜8、前扫描振镜9、前光束准直透镜10、后光束准直透镜11、后扫描振镜12、前扫描模块透镜13、后扫描模块透镜14、显微物镜15、实验样品16、光学滤波器17、准直聚焦透镜18、光纤19、聚焦透镜20和光电倍增管21。

(1)激光器1发出的光束依次经过光纤2和准直透镜3后，照射到数字微镜器件4上。在数字微镜器件4无加载图像且不加载实验样品16时，光束被反射经过前缩束模块透镜6和后缩束模块透镜7，照射到二向色镜8的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜9、前光束准直透镜10、后光束准直透镜11、后扫描振镜12、前扫描模块透镜13和后扫描模块透镜14后进入显微物镜15，并在焦平面处形成理想的聚焦光斑，记聚焦光斑中心在焦平面的位置为of。

(2)加载实验样品16，数字微镜器件4无加载图像时，激光器1发出的光束依次经过光纤2和准直透镜3后，照射到数字微镜器件4上，光束被反射经过前缩束模块透镜6和后缩束模块透镜7，照射到二向色镜8的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜9、前光束准直透镜10、后光束准直透镜11、后扫描振镜12、前扫描模块透镜13和后扫描模块透镜14后进入显微物镜15，并在实验样品16内焦平面处形成畸变的散射聚焦光斑，并激发出荧光。

(3)荧光从实验样品16内发射进入显微物镜15，然后依次经过后扫描模块透镜14、前扫描模块透镜13、后扫描振镜12、后光束准直透镜11、前光束准直透镜10、前扫描振镜9、二向色镜8、光学滤波器17、聚焦透镜18和光纤19、聚焦透镜20后进入光电倍增管21进行光强探测，通过扫描得到无数字微镜器件筛选时的散射聚焦光斑图像，如图2所示。记此时of对应位置的光强值。在本具体实施案例中由于光强最强点偏移，of对应位置的光强值为43.77。

(4)在本具体实施案例中将数字微镜器件的微镜像素元以32×32方式均匀分为1024个区域，从而将准直扩束后的入射光束分为对应的1024个光束单元。将1024个分区等分为无共同分区的两大部分，根据奈奎斯特采样定律选择合适的调制频率，使得每个部分中的每个分区都有不同的强度调制频率。保持第二部分的分区不变，第一部分内的各分区内的微镜同时以对应的不同频率进行振动，使得光束以对应的频率在后续光路与旁侧光路的光挡之间来回偏转，从而对不同分区的光束进行不同频率的强度调制。由光电倍增管实时记录在of处的荧光光强值。在本具体实施案例中，1024个分区等分的情况如图3与图4所示，所采用的最大调制频率为204.8hz、频率间隔为0.2hz；光电倍增管探测到的强度调制后的部分荧光光强值如图5所示。

(5)将步骤(4)所得光强值做傅里叶变换，傅里叶变换后绘制的频率-幅值图如图6所示，并在各分区对应的频率上求得对应的补偿相位。保留相位值小于等于π的分区并去除相位值大于π的分区，得到筛选分区图像。从荧光光强值中计算得到的部分分区补偿相位值如图7所示；第一部分分区所需进行相位补偿的分区分布图如图8所示；第二部分分区所需进行相位补偿的分区分布图如图9所示。

(6)将筛选分区图像加载到到数字微镜器件4上，入射光束经光纤2和准直透镜3后，照射到数字微镜器件4上，被去除的分区对应的光束被反射至旁侧光路的光挡5上，从而不参与聚焦，被保留的分区对应的光束被反射经过前缩束模块透镜6和后缩束模块透镜7，照射到二向色镜8的侧面被反射，反射光束经过前扫描振镜9、前光束准直透镜10、后光束准直透镜11、后扫描振镜12、前扫描模块透镜13和后扫描模块透镜14后进入显微物镜15，并在实验样品16内焦平面处形成最终的光束聚焦增强光斑，并激发更强的荧光。在本具体实施案例中数字微镜器件筛选后需要补偿的分区分布图如图10所示。

(7)经过光束聚焦增强后激发的荧光从实验样品16内发射进入显微物镜15，然后依次经过后扫描模块透镜14、前扫描模块透镜13、后扫描振镜12、后光束准直透镜11、前光束准直透镜10、前扫描振镜9、二向色镜8、光学滤波器17、聚焦透镜18、光纤19和聚焦透镜20后进入光电倍增管21进行光强探测，通过扫描得到数字微镜器件4加载筛选分区进行光束聚焦增强后的聚焦光斑图像，如图11所示，在本具体实施案例中该图像of位置对应的光强值为286.1。

传统的相干光自适应技术采用空间光调制器进行相位的探测。假设将空间光调制器分成32×32个分区，每个分区各自以一定的相位间隔同时改变对应光束的相位，经过光强探测后计算得到需要进行校正的相位值。假设空间光调制器工作时的图像加载速率上限为60hz，加载相位间隔所消耗的时间受空间光调制器的速率限制，采样点数为2048，因此完成一次光学聚焦相位探测所需要的时间为：

而本发明所使用的数字微镜器件的图像刷新率上限为22727hz，同样将其分为32×32个分区，分区之间的调制频率间隔为22727/1024hz≈22.19hz，取22hz则其完成一次光束聚焦增强分区的筛选时间为：

由于采用空间光调制器进行相干光学自适应技术的处理时间受限于空间光调制器的图像刷新率。而本发明利用数字微镜器件快速的图像刷新率，极大地减少了光束聚焦增强所需要的处理时间，显著提升了光束聚焦增强的处理速度。

由上述实施例可见，本发明基于数字微镜器件的快速精准光学聚焦增强方法与系统简单、便捷，能够在简单、快速的相干光自适应补偿相位探测之后，将对光束聚焦中心干涉相消的光束分区进行剔除，保留对中心光强有贡献的干涉相长的光束分区，从而将目标光束聚焦点的光强提升约553.6％。相比于利用空间光调制器进行逐次相位校正以及基于相干光自适应技术的空间光调制器相位补偿，本发明能够在提升聚焦光斑中心光强的同时缩短校正时间，为光遗传学光刺激与实时成像提供了更低成本更便捷的实验技术，提升了实验效率。