一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，属于卫生检 测技术领域。
【背景技术】
[0002] 水环境的有机物污染是一个全球性的问题，其严重程度、性质和危害伴随着工业 的发展而不断变化，饮用水中有机物的来源广泛，一是外界向水体中排放的有机物；二是 水体中水生生物的分解代谢产物及齡泥释放的内源污染物；H是饮用水氯化消毒过程中， 生成的种类繁多的消毒副产物，该些外源化学物在体内经生物转化而形成终毒物，包括亲 电子剂、自由基、亲核物和氧化还原反应物四类，其中自由基具有较高的反应活性，容易快 速与细胞内的大分子物质发生反应，诱导膜脂质过氧化、蛋白质及核酸的氧化损伤，从而 引起许多与病理过程有关的细胞结构的广泛损伤，研究表明，由自由基引起的蛋白质氧化 性损伤与衰老及阿尔茨海默症（AD)、帕金森氏病（PD)等神经退行性疾病的发生有关。还有 研究证实，高血压、动脉粥样硬化、恶性肿瘤、糖尿病、哮喘、白内障等众多疾病与蛋白质的 氧化损伤关系紧密，且某些氧化产物在一定程度上又能反映疾病的发展及状态，因此，测定 蛋白质撰基（PC0)含量对衡量自由基对机体的损伤有着实际意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是；提供一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法， 能快速检测有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤，，W克服现有技术的不足。
[0004] 本发明的技术方案 一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，该方法利用固相萃取法提取 有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，感染12周W后采用用2, 4-二硝基苯脱比色 法检测蛋白质撰基，W达到快速明显检测大鼠肝脏蛋白质氧化损伤过程。
[0005] 前述的一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法中，大鼠选取40 只，雌雄各半，体重80?lOOg，染毒前适应性饲养1周，自由进食饮水，在染毒期间，清洁级 动物房相对湿度为50%?70%，温度为23 +2°C。
[0006] 前述的一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法中，采用固相萃取 法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲焼和甲醇，水样过柱流速为 4倍柱体积/min,过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲焼和甲醇先后洗柱，流速0. 1倍柱体 积/min,洗脱液经旋转蒸发仪25C减压蒸觸挥干，将已挥干的浓缩提取物用玉米油定容至 5化/ml (母液）-200C冰箱保存备用。
[0007] 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明中饮用水有机污染物经过 ADME过程作用于大鼠肝组织蛋白质，主要攻击蛋白质氨基酸的侧链而生成撰基；饮用水有 机污染物代谢物(轻基自由基）直接作用于肤键，使肤键断裂并产生撰基；与非蛋白撰基化 合物结合，如丙二酵是含氧的撰基化合物，它能够插入到蛋白质内部引起蛋白质撰基上升， 说明饮用水有机物对大鼠肝脏的氧化损伤指标中，肝组织PCO比肝组织MDA更加敏感。
【具体实施方式】
[0008] 下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[000引本发明的实施例： 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1主要试剂 XAD-2大孔树脂（20-60目，美国Sigma公司，）、甲醇、二氯甲焼，均为分析纯（美国 T邸IA公司）、玉米油（美国Sigma公司）、生理盐水、0.9%戊己比妥轴（美国Sigma公司）、 蛋白质撰基（PC0)测试盒（南京建成生物工程研究所）。
[0010] 1.1.2主要仪器 1/%。电子天平（中国奧豪斯公司）、索氏提取器（索氏管+冷凝管+l〇〇〇ml烧瓶）、台式 离也机CTOL80-2B，上海安亭科学仪器厂）、721型可见光分光光度计（山东高密彩虹分析仪 器有限公司）、快速混匀器狂脚6-A，姜眶市新康医疗器械有限公司）、制冰机狂B130,宁波 格兰特制冷设备制造有限公司）、WPC纯水仪（四川沃特尔科技发展有限公司）等。
[0011] 1.2 方法 利用课题组前期制备的大鼠饮用水有机污染物亚慢性染毒模型进行本实验。相关内容 介绍如下： 1. 2. 1实验动物 清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重80?lOOg，由中国人民解放军第H军医大学提 供，合格证号SCXK (渝）2012-0003 ;染毒前适应性饲养1周，自由进食饮水；在染毒期间，清 洁级动物房相对湿度为50%?70%，温度为23 + 2°C。
[0012] 1.2.2水样采集与处理 采集G市某地管网末梢水水样，采用固相萃取法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2 树脂，洗脱剂为二氯甲焼和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积/min,过柱完后依次用3倍柱 体积的二氧甲焼和甲醇先后洗柱，流速0. 1倍柱体积/min,洗脱液经旋转蒸发仪25C减压 蒸觸挥干，将已挥干的浓缩提取物用玉米油定容至50L/ml (母液）-200C冰箱保存备用。
[0013] 1.2.3实验分组、染毒及取材 根据参考文献及预实验结果，按区间随机分组方法将SD大鼠分为4组，每组10只， 雌雄各半；其中1个溶剂对照组(玉米油)，3个染毒组，其染毒剂量由低到高分别为化/ kgBW ? day、20L/kgBW ? day、80L/kgBW ? day。经口灌胃染毒，灌胃体积 0. OlL/kgBW ? day,每 天1次，每周染毒5天，连续染毒12周。最后一次染毒结束后，用0. 9%戊己比妥轴麻醉大 鼠，采集肝脏，制备肝组织匀浆备用。
[0014] 1.2.4大鼠肝脏蛋白质撰基的测定与计算 用2, 4-二硝基苯脱（DNPH)比色法检测蛋白质撰基，取大鼠肝组织0. Ig，加入蛋白裂解 液研磨，llOOOr/min离也lOmin后取0. 1ml上清液待测，加入0. 4mlDNPH，混匀后37°C避光 反应30分钟。加入0. 5ml20%的H氯己酸；4°C下12000;r/min离也15min，弃上清；用1. 0ml 己醇和己酸己醋混合物（1:1体积比)洗3次；沉淀用1. 25ml的6mol/L盐酸脈溶液溶解，混 匀后在37°C水浴中放置15min，120(K)r/min离也15min，取上清液；在370皿处W对应空白 做参比，在370nm处测定其吸光度值（OD)。 大鼠肝组织蛋白质撰基（PCO)含量计算公式：
【主权项】
1. 一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，其特征在于：该方法利 用固相萃取法提取有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，感染12周以后采用用 2, 4-二硝基苯肼比色法检测蛋白质羰基，以达到快速明显检测大鼠肝脏蛋白质氧化损伤过 程。
2. 根据权利要求1所述的一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，其 特征在于：大鼠选取40只，雌雄各半，体重80?100g，染毒前适应性饲养1周，自由进食饮 水，在染毒期间，清洁级动物房相对湿度为50%?70%，温度为23 ±2°C。
3. 根据权利要求1所述的一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，其 特征在于：采用固相萃取法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲烷 和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇先 后洗柱，流速〇. 1倍柱体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25 °C减压蒸馏挥干，将已挥干的浓缩 提取物用玉米油定容至50L/ml (母液）-200C冰箱保存备用。
【专利摘要】本发明公开了一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，该方法利用固相萃取法提取有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，感染12周以后采用2,4-二硝基苯肼比色法检测蛋白质羰基，以达到快速明显检测大鼠肝脏蛋白质氧化损伤过程，本发明中饮用水有机污染物经过ADME过程作用于大鼠肝组织蛋白质，主要攻击蛋白质氨基酸的侧链而生成羰基；饮用水有机污染物代谢物（羟基自由基）直接作用于肽键,使肽键断裂并产生羰基；与非蛋白羰基化合物结合，如丙二醛是含氧的羰基化合物，它能够插入到蛋白质内部引起蛋白质羰基上升，说明饮用水有机物对大鼠肝脏的氧化损伤指标中，肝组织PCO比肝组织MDA更加敏感。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104569421
【申请号】CN201410740584
【发明人】敖云霞
【申请人】敖云霞
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月8日