一种喘可治注射液4种黄酮类有效成分检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种喘可治注射液有效成分的检测方法。
【背景技术】
[0002] 喘可治注射液是国家二类中药新药，系由淫羊藿和巴戟天药材组成，具有温和补 肾，平喘止咳，有抗过敏、增强体液免疫与细胞免疫的功能，且毒副反应小，药用机理明确， 在免疫功能紊乱性疾病如哮喘、慢性支气管炎的临床应用前景广阔。
[0003] 喘可治注射液中含有主要成分为黄酮苷，黄酮苷分别为朝藿定A、朝藿定B、朝藿 定C及淫羊藿苷的含量，这些黄酮苷来自淫羊藿药材。淫羊藿药材来源多，成分复杂质量不 好控制。目前喘可治注射液所用的箭叶淫羊藿药材未见对朝藿定A、朝藿定B的定量分析， 现行的喘可治注射液含量测定方法只需考察朝藿定C与淫羊藿苷的量，还没有对其它黄酮 类成分的含量分析。
[0004] 液相质谱联用技术因分析快速、样品处理简洁、灵敏度高而越来越频繁地用于中 药质量分析中。因此本研究采用高效液相色谱-串联质谱法快速、准确测定喘可治注射液 中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷这4种黄酮苷的含量，为喘可治注射液提供更加 完备可靠的质量控制手段。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种喘可治注射液4种黄酮类有效成分检 测方法，该方法稳定可靠，能够真是反映产品的内在质量，操作简单，适合产业化的日常检 验工作。
[0006] 本发明的一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，包括如下步骤：
[0007] (1)对照品溶液的制备：取对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，用甲 醇或流动相溶解即得；
[0008] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，用甲醇或流动相溶解即得；
[0009] (3)供试品溶液的制备：取喘可治注射液用甲醇或流动相稀释即得；
[0010] ⑷检测方法：色谱质谱联用，所述的色谱条件，色谱柱C18、流动相：乙腈-酸水溶 液；所述的质谱条件，辅助气化电喷雾离子源ESI、多反应离子监测MRM模式负离子检测。
[0011] 进一步优选步骤（1)中所述的对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分 别配置成lmg/ml的对照品贮备液；再分别精密量取对照品储备液置于同一量瓶中，加入甲 醇稀释配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为1000ng/ml的混合对照品储备 液。
[0012] 更进一步优选步骤（1)所述的对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷各 约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成4种对照品储备 液；再分别精密量取4种对照品储备液置于同一 IOml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度配制成 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为1000ng/ml的混合对照品储备液。
[0013] 上述步骤（2)中内标溶液的制备，进一步地，步骤（2)所述的柚皮苷对照品配制成 lmg/ml的内标备液，通过稀释步骤配制成2μ g/ml内标溶液。
[0014] 上述步骤⑵中所述的稀释步骤是指取内标储备液置于量瓶中，加入甲醇或流动 相配制成100 μ g/ml内标次级储备溶液，精密吸取内标次级储备液置于量瓶中，加入甲醇 或流动相配制成2 μ g/ml内标溶液。
[0015] 进一步地，步骤（2)取柚皮苷对照品约10mg，精密称定，置于IOml量瓶中，加甲 醇溶解并稀释至刻度，配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置IOml量瓶中，加 入流动相稀释至刻度，摇匀，得1〇〇μ g/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液 200 μ 1，置IOml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液（2 μ g/ml)。
[0016] 本发明步骤（3)所述供试品制备，进一步地，用流动相稀释喘可治注射液，精密量 取1000-2000 μ 1并加入1/5倍内标溶液混合均匀，滤膜，取续滤液，得供试品溶液。
[0017] 更进一步，步骤（3)用流动相稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000 μ 1加内 标工作液200 μ 1，涡旋40s，过0. 22 μ m滤膜，取续滤液，得供试品溶液。
[0018] 本发明所述的步骤⑷检测方法，其中所述的色谱条件：C18色谱柱 (50-150) X2. 1mm，粒径3. 0~5. Oym ;流动相：乙腈：0. 1~1%甲酸水溶液，等度洗脱 (30-40:60-70)进样量：5~20μ L，柱温：35~45°C，流速0· 2~0· 3mL/min。所述的质 谱条件：辅助气化电喷雾离子源ESI ;多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对 分别为：m/z 883. 4 - 675. 2 朝藿定 A，m/z 853. 5 - 645. 3 朝藿定 B，m/z 867. 4 - 659. 4 朝藿定C，m/z 721.3 -513. 2淫羊藿苷，m/z 579. 2 - 271. 1柚皮苷，辅助气化气流量： 7000~8000CC/min，雾化气流量：6~10L/min，气帘气流量：5~8L/min，离子源喷雾电 压：-3800~-4500V，离子源雾化温度：350-400°C。
[0019] 上述步骤（1)-⑷中所述的流动相是乙腈-0.1~1%酸水溶液，所述的酸包括但 不限于为甲酸、乙酸中一种或以上。优选流动相为乙腈-〇. 1%甲酸水溶液。
[0020] 本发明最佳的检测方法，包括如下步骤：
[0021] (1)对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷加甲醇溶解并稀 释至刻度，配制成4种lmg/ml对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量， 置IOml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液；
[0022] (2)内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，精密称定，置于量瓶中，加甲醇溶解并稀 释至刻度，配制成lmg/ml内标储备液。精密量取内标储备液适量，置于量瓶中，加入乙 腈：〇. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀释至刻度，摇匀，得100 μ g/ml内标次级储备溶液。精密吸 取内标次级储备液置量瓶中，加乙腈：〇. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内 标工作液（2 μ g/ml);
[0023] (3)供试品溶液制备：用乙腈：0. 1%甲酸水溶液（35:65)稀释喘可治注射液2000 倍，精密量取1000 μ 1加内标工作液200 μ 1，涡旋40s，过0. 22 μ m滤膜，取续滤液，得供试 品溶液；
[0024] (4)检测条件：
[0025] 色谱条件
[0026] 色谱柱(：18150父2.1臟，5.(^111、流动相乙腈：0.1%甲酸水溶液35 :65、等度洗脱 3. 5min、进样量 10 μ 1、柱温 40°C、流速 0· 22ml/min ;
[0027] 质谱条件
[0028] 辅助气化电喷雾离子源ESI ;多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分 别为：111/2 883.4 - 675.2朝藿定六，111/2 853.5 - 645.3朝藿定8，111/2 867.4 - 659.4朝藿 定(：，111/2 721.3 - 513.2淫羊藿苷，111/2 579.2 - 271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500〇：/ min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温 度：350°C。
[0029] 有益效果
[0030] 为了更好的阐述本发明的有益效果，通过下述试验证明
[0031] 试验例一、方法学考察
[0032] 1材料、试剂与仪器
[0033] I. 1标准品
[0034] 朝藿定A (批号：121106,纯度：98.8%) 上海融禾医药科技有限公司 朝藿定B (批号：121109,纯度：98.6%) 上海融禾医药科技有限公司 朝藿定C (批号：111780-200801,纯度：99.1%)中国药品生物制品检定所 淫羊藿苷（批号：0737-9910，纯度：98.5%) 中国药品生物制品检定所 柚皮苷（批号：0722-200108,纯度：99.7%) 中国药品生物制品检定所
[0035] 它们的化学结构式见图1。
[0036] 1. 2 试剂
[0037] 甲醇（色谱级美国Fisher Scientific公司）、乙腈（色谱级美国Fisher Scientific公司）甲酸广州化学试剂厂、纯水、超纯水（Milli-Elix, Milli-Q制水系统）
[0038] L 3供试品
[0039] 喘可治注射液（批号：13052501,13052801，13052601，11121001，13022502， 13052702, 12081502,13052902,13042702,12072001,12092301,12071902,13053002, 13030102，20110305)由广州万正药业有限公司提供。
[0040] 1. 4 仪器
[0041] APBOOO型液相色谱-三级四重杆质谱联用仪 美国AB公司 Milli-Elix，Milli-Q 制水系统 ：? 11、:丨 Millipore 公， PL303电子天平（千分之一)