一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶comt活性的方法
【技术领域】
[0001] 一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法， 属于毛细管电泳检测及儿茶酚氧甲基转移酶检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT)广泛存在于神经系统及机体组织内，是儿茶酚胺类 神经递质的主要代谢酶之一。COMT是脑内前额叶皮层多巴胺水平的主要调节器，已有文献 报道抑郁与脑内多巴胺功能失调有关。而评价脑内多巴胺功能状况的方法之一是测定COMT 的活性浓度。
[0003] 随着社会的高速发展，工作、生活及精神压力的增加，抑郁症的发病率逐年上升。 据世界卫生组织统计每45000万精神疾病的患者中有15000万是抑郁症患者。抑郁症给患 者、家人带来极大的痛苦。因此，研究抑郁症的发病机制及药物的作用靶点对抑郁症的防治 极为重要。
[0004] 国内外神经科学研究者相继进行了一些关于抑郁症患者红细胞COMT活性浓度的 检测研究。文献报道的COMT的活性测定方法有放射性检测法，但其对环境存在污染；而荧 光法测定必须进行衍生化，操作复杂；电化学法检测法需特殊的检测器。我们以3, 4-二羟 基苯甲酸为底物，建立了毛细管电泳快速检测COMT活性的分析方法，该方法简便快速，未 见文献报道。
[0005] 文献报道慢性应激诱导氧化性损伤可导致抑郁、焦虑等精神性紊乱疾病。使用慢 性应激法使动物每天处于无法预期的压力环境中使其出现抑郁症状可以成功建立抑郁症 模型。PQQ(化学名称为4, 5-二氢-4, 5-二氧化-1-氢吡咯（2, 3f)醌-2, 7, 9 一三羧酸)， 它具有很强的自由基清除作用，并具有提高认知功能等作用，它在神经精神疾病方面具有 较重要的研究前景。PQQ对于氧化性损伤诱发的抑郁症是否具有修复作用，能否作为新的治 疗靶点对抑郁症的发病机制和治疗是值得深入研究的。
[0006] 本发明用所建立的毛细管电泳方法研究PQQ对慢性应激诱导氧化性损伤所致抑 郁模型鼠脑内COMT活性的变化，未见文献报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移 酶COMT活性的方法。
[0008] 本发明的技术方案：一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶 COMT活性的方法，步骤为： (1)毛细管选择及预处理： 选用未涂层石英毛细管柱（45cmX50Mffl，河北永年县锐沣色谱器件有限公司），新毛 细管柱先依次用甲醇冲洗l〇min，蒸馏水冲洗5min，IMNaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗 5min,最后再用运行缓冲液冲洗15min;进样前依次用蒸馈水及运行缓冲液各冲洗2min; 运行缓冲液为：200mmol/LPBS体积百分60%+75mmol/L硼酸体积百分40%的缓冲体 系，PH=IO，含缓冲体系体积百分0. 05%三氟乙酸； (2)毛细管电泳分析条件： 检测波长是350nm，进样方式为压力进样（0. 5psi，10. 0s)，分离电压为25kv,毛细管 柱温25°C，运行缓冲溶液为：60% 200mMPBS+40% 75mM硼酸（pH10. 0)含0. 05%的三氟乙 酸。缓冲液及样品溶液均用〇. 22Mm微孔针头过滤器过滤。
[0009] 测定原理 在Mg2+(MgCl2)和SAM(S-腺苷甲硫氨酸）的存在下，COMT催化底物3, 4-二羟基苯甲 酸，生成产物4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，以3, 4-二羟基苯甲酸标准品外标法测定组织液中 剩余3, 4-二羟基苯甲酸的浓度，COMT酶活以测定单位时间内每毫克蛋白转化生成的产物 量表示。
【主权项】
1. 一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，其 特征在于步骤为： (1) 毛细管选择及预处理： 选用未涂层的45cmX50Mffl石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗lOmin，蒸馏 水冲洗5min，IM NaOH溶液冲洗30min，蒸馈水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗15min ; 进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲洗2min ; 运行缓冲液为：200mmol/L PBS体积百分60%+75 mmol/L硼酸体积百分40%的缓冲体 系，PH=IO，含缓冲体系体积百分0. 05%三氟乙酸； (2) 毛细管电泳分析条件： 检测波长为350nm，进样方式为0. 5psi压力进样，进样时间10.0 s,分离电压为25kV，毛 细管柱温25°C ; (3) 标准曲线的建立： 标准溶液的配制：精密称取对照品3,4-二羟基苯甲酸0.0058，溶于51^501111?85缓冲 液配成lmg/mL的储备液，用该缓冲液稀释成25、50、100、150、200μ g/mL的3, 4-二羟基苯 甲酸标准溶液进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，结果在25-200 μ g/ mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y=166111x+11747,相关系数r2=0. 9951，在25~ 200μ8/ιΛ浓度范围内呈良好的线性关系，最低检出浓度为0.02~0. 5μΜ，S/N彡3 ; (4) 脑组织COMT酶活性测定 (4. 1)样品的制备： 脑组织处理： 脑组织精密称重，加入组织裂解液，脑组织重量：组织裂解液=lg:7.5mL，匀浆， 4°C HOOOg离心15min，取上清液A ;上清液A再HOOOg离心15min，取二次离心后上清液 B，上清液B于-80°C冰箱保留；组织裂解液为含0. 6M高氯酸PCA和0. 5mM EDTA二钠，即 16. 6mL PCA和0. 092g EDTA二钠溶于500mL水配制而成； 测试前先低温解冻上清液B，再加入等体积的含I. 2M K2HPOjP 2mM EDTA二钠的溶液， 称为PCA沉淀剂，用于沉淀反应剩余的PCA，冰浴中放置IOmin后4°C HOOOg离心15min，取 上清液C，即COMT酶液；之后进行酶反应体系孵育； (4. 2)酶反应体系制备： 2mM 氯化镁 100 μ L +0· 2mM SAM 100 μ L+0. 2mM 3, 4-二羟基苯甲酸 150 μ L+ 最后离心 出来的上清液C 150 μ L，反应体系总体积为500 μ L，漩涡振荡后于37°C孵育60min ;之后加 入80 μ L冰冷2M PCA终止反应，16000g离心15min为上清液D，取上清液D为待测物； 按步骤（1)所述毛细管电泳分析条件进样，所得峰面积代入标准曲线回归方程计算得 到反应剩余3, 4-二羟基苯甲酸的浓度，计算单位时间内转化为3-羟基4-甲氧基-苯甲酸， 即为COMT活性：
<1000, μ M/g. min, Ctl为3, 4-二羟基苯甲酸起始浓度，C为反应剩余3, 4-二羟基苯甲酸浓度，t min为反应 孵育时间min, G为脑组织重量g。
【专利摘要】一种用毛细管电泳快速检测生物样本中儿茶酚氧甲基转移酶COMT活性的方法，属于毛细管电泳检测技术及儿茶酚氧甲基转移酶检测技术领域。本发明所建立的方法分析慢性应激诱导氧化性损伤抑郁症大鼠以及叶酸和不同剂量PQQ腹腔注射后脑组织COMT活性的变化，未见文献报道，为抑郁症的发病机制和药物作用靶点提供新的依据。本发明所采用的毛细管电泳法分析速度更高，分离度更好，能快速检测脑组织中COMT活性浓度，与以往检测COMT的方法相比具有明显优势，不需要衍生化，与文献方法相比，本方法具有更好的可靠性和选择性，而且具有灵敏度高、分析速度快等特点。
【IPC分类】G01N27-447
【公开号】CN104655705
【申请号】CN201510073846
【发明人】周杏琴, 毛师师, 钦晓峰
【申请人】江苏省原子医学研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月12日