一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测宫颈脱落细胞刚度的方法，特别是关于一种应用原子力显微 镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤。全世界每年有超 过20万妇女死于宫颈癌。近年来，随着微尺度生物力学的发展，发现肿瘤细胞的微区力学 性质与肿瘤的发生发展以及细胞侵袭力和转移力密切相关，可能成为肿瘤早期诊断的重要 指标。
[0003] 原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM)是一种新近发展起来的利用其非 修饰和修饰探针进行样品扫描，可以得到样品表面形貌，并获得样品表面某一特定点的力 与进针距离的关系曲线，进而得到硬度和粘性等数据以及样品的微区力学性质。原子力显 微镜可在生理条件下对活细胞进行实时动态观察，样本制作简单，并可实时动态观察某些 生化反应，且无需对样品进行化学处理就可以产生高分辨率的图像，可达纳米水平。AFM对 细胞损伤小，通过一种类似于内科触诊的模式，还可以对细胞骨架及其他细胞内部微细结 构进行成像。相对于光学显微镜和电子显微镜，原子力显微镜具有突出的优点。
[0004] 如何利用原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM)检测人正常子宫颈上皮 细胞、宫颈癌前病变（CIN)和宫颈癌的脱落细胞的刚度，建立一套系统的检测方法，以便为 寻找癌变过程中微观力学指标的变化规律，为临床上开展宫颈癌前病变和宫颈癌的早期诊 断提供依据和思路成为亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚 度的方法，该方法操作简便、无创伤，可以有效寻找癌变过程中微观力学指标的变化规律。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种应用原子力显微镜检测宫颈脱 落细胞刚度的方法，其包括以下步骤：1)采集宫颈上皮脱落细胞标本；2)制备宫颈上皮脱 落细胞样品；3)采用现有原子力显微镜成像系统检测宫颈上皮脱落细胞样品的力-距离曲 线；（1)在原子力显微镜成像系统中采用原子力显微镜，在原子力显微镜成像系统扫描头 上安装前段修饰有聚苯乙稀小球的CSGll/tipless型微悬臂，调整激光光斑位置使其位于 扫描头毛玻璃正中央，并将偏转以及扭转的初始值分别设为-2V和0V，通过预置在原子力 显微镜成像系统中的Contact mode AFM Calibrated软件对微悬臂进行力-距离曲线采 集，从而计算出微悬臂的弹性系数和敏感度；(2)将培养皿固定于原子力显微镜成像系统 的样品盘上，将探针安装在对微弱力极敏感的微悬臂一端，微悬臂另一端固定在原子力显 微镜成像系统中的压电陶瓷管上，探针与培养皿中的样品表面轻轻接触，测得微悬臂对应 于扫描点各点位置的变化，获得样品表面的形貌信息；(3)每个患者取10个以上形态正常、 锚定良好的宫颈上皮脱落细胞样品，在目视下选择要采集力-距离曲线的部位，每个细胞 样品在胞浆区取两个点进行力-距离曲线检测；(4)选择进针时间，在所选进针时间测定的 力-距离曲线代表探针在逐渐逼近样品、接触样品、局部施力下压、针尖逐渐抬起以及离开 细胞的全过程中，微悬臂的振幅改变，得到力-距离曲线，将所测定的力-距离曲线以*.ivs 格式输出；4)根据测得的力-距离曲线对宫颈上皮脱落细胞刚度进行检测；（1)将*. ivs格 式力-距离曲线文件转换为*. txt格式力-距离曲线文件，并采用Cft3bal 1计算方法，输入 以下参数：压入深度、微悬臂敏感度、微悬臂弹性系数和微悬臂末端小球的半径，对*. txt 格式力-距离曲线文件进行杨氏模量计算；（2)杨氏模量大小与细胞的刚度呈负相关，根据 步骤（1)中计算得到的杨氏模量大小得到宫颈上皮脱落细胞的刚度变化值。
[0007] 所述步骤2)中，所述宫颈上皮脱落细胞样品制备方法如下：⑴将附着有宫颈上 皮脱落细胞标本的宫颈刷浸入IOml PBS缓冲液中；（2)用2ml吸管将宫颈上皮脱落细胞从 宫颈刷上轻轻吹下，反复吹打成细胞悬液；（3)在15ml的离心管中加入4ml密度梯度离心 液，在离心液上轻柔加入步骤（2)中的IOml细胞悬液，并进行60g离心3分钟；去除IOml 含有粘液和血液的上清，将剩余液体再次进行200g离心3分钟；(4)弃上清，加入2ml PBS 缓冲液，轻轻吹打成单细胞悬液；(5)将单细胞悬液滴于0. 1 %多聚赖氨酸处理的培养皿底 和盖玻片上，静置30分钟后待细胞基底附着后用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，最后在培养皿 中加入2ml PBS缓冲液准备检测。
[0008] 所述步骤3)的步骤（1)中，所述微悬臂前端聚苯乙烯小球直径为7 μ m。
[0009] 所述步骤4)的步骤（1)中，所述杨氏模量采用由Hertz'S模型计算：
【主权项】
1. 一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其包括以下步骤： 1) 采集宫颈上皮脱落细胞标本； 2) 制备宫颈上皮脱落细胞样品； 3) 采用现有原子力显微镜成像系统检测宫颈上皮脱落细胞样品的力-距离曲线； (1) 在原子力显微镜成像系统中采用原子力显微镜，在原子力显微镜成像系统扫描头 上安装前段修饰有聚苯乙稀小球的CSGll/tipless型微悬臂，调整激光光斑位置使其位于 扫描头毛玻璃正中央，并将偏转以及扭转的初始值分别设为-2V和0V，通过预置在原子力 显微镜成像系统中的Contact mode AFM Calibrated软件对微悬臂进行力-距离曲线采集， 从而计算出微悬臂的弹性系数和敏感度； (2) 将培养皿固定于原子力显微镜成像系统的样品盘上，将探针安装在对微弱力极敏 感的微悬臂一端，微悬臂另一端固定在原子力显微镜成像系统中的压电陶瓷管上，探针与 培养皿中的样品表面轻轻接触，测得微悬臂对应于扫描点各点位置的变化，获得样品表面 的形貌信息； (3) 每个患者取10个以上形态正常、锚定良好的宫颈上皮脱落细胞样品，在目视下选 择要采集力-距离曲线的部位，每个细胞样品在胞浆区取两个点进行力-距离曲线检测； (4) 选择进针时间，在所选进针时间测定的力-距离曲线代表探针在逐渐逼近样品、接 触样品、局部施力下压、针尖逐渐抬起以及离开细胞的全过程中，微悬臂的振幅改变，得到 力-距离曲线，将所测定的力-距离曲线以*· ivs格式输出； 4) 根据测得的力-距离曲线对宫颈上皮脱落细胞刚度进行检测； (1) 将*· ivs格式力-距离曲线文件转换为*· txt格式力-距离曲线文件，并采用 Cft3ball计算方法，输入以下参数：压入深度、微悬臂敏感度、微悬臂弹性系数和微悬臂末 端小球的半径，对*. txt格式力-距离曲线文件进行杨氏模量计算； (2) 杨氏模量大小与细胞的刚度呈负相关，根据步骤（1)中计算得到的杨氏模量大小 得到宫颈上皮脱落细胞的刚度变化值。
2. 如权利要求1所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其特征 在于：所述步骤2)中，所述宫颈上皮脱落细胞样品制备方法如下： (1) 将附着有宫颈上皮脱落细胞标本的宫颈刷浸入IOml PBS缓冲液中； (2) 用2ml吸管将宫颈上皮脱落细胞从宫颈刷上轻轻吹下，反复吹打成细胞悬液； (3) 在15ml的离心管中加入4ml密度梯度离心液，在离心液上轻柔加入步骤⑵中的 IOml细胞悬液，并进行60g离心3分钟；去除IOml含有粘液和血液的上清，将剩余液体再 次进行200g离心3分钟； (4) 弃上清，加入2ml PBS缓冲液，轻轻吹打成单细胞悬液； (5) 将单细胞悬液滴于0. 1 %多聚赖氨酸处理的培养皿底和盖玻片上，静置30分钟后 待细胞基底附着后用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，最后在培养皿中加入2ml PBS缓冲液准备 检测。
3. 如权利要求1所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其特征 在于：所述步骤3)的步骤（1)中，所述微悬臂前端聚苯乙烯小球直径为7 μ m。
4. 如权利要求2所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其特征 在于：所述步骤3)的步骤（1)中，所述微悬臂前端聚苯乙烯小球直径为7 μ m。
5. 如权利要求1~4任一项所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方 法，其特征在于：所述步骤4)的步骤（1)中，所述杨氏模量采用由Hertz's模型计算：
式中，E是所求的杨氏模量，F是所施加的力，R是微悬臂末端小球半径，δ是压入深度， υ 是 Poisson' s 比。
6. 如权利要求1~4任一项所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方 法，其特征在于：所述步骤3)的步骤（4)中，所述进针时间的选取范围为0.0 ls~10s。
7. 如权利要求5所述的一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其特征 在于：所述步骤3)的步骤（4)中，所述进针时间的选取范围为0.0 ls~10s。
【专利摘要】本发明涉及一种应用原子力显微镜检测宫颈脱落细胞刚度的方法，其包括步骤：采集宫颈上皮脱落细胞标本；制备宫颈上皮脱落细胞样品；采用现有原子力显微镜成像系统检测宫颈上皮脱落细胞样品的力-距离曲线，将所测定的力-距离曲线输出；根据测得的力-距离曲线对宫颈上皮脱落细胞刚度进行检测：采用Cft3ball计算方法，输入以下参数：压入深度、微悬臂敏感度、微悬臂弹性系数和微悬臂末端小球的半径，对力-距离曲线文件进行杨氏模量计算；杨氏模量大小与细胞的刚度呈负相关，根据计算得到的杨氏模量大小得到宫颈上皮脱落细胞的刚度变化值。本发明可以广泛在生物医学、纳米生物和生物力学领域中应用。
【IPC分类】G01Q60-24, G01N3-00
【公开号】CN104655879
【申请号】CN201510097486
【发明人】耿力
【申请人】北京大学第三医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月5日