脲酶米氏常数测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脲酶米氏常数测定方法，属于生物化学和应用酶学技术领域。
【背景技术】
[0002]脲酶又称酰胺基水解酶，广泛存在于各种细菌、真菌、植物、动物和人体中，可以快速催化尿素水解生成氨和二氧化碳。脲酶的催化特性在各个领域被广泛的研宄:医学上，脲酶与肾炎、肝昏迷和消化溃疡等发病机理密切相关；农业上，尿素的过快水解易导致植物幼株的氮中毒或碱诱导植物的损害；尿素的非生产性对环境也造成了一定的污染，因此对脲酶进行研宄具有重要的意义。
[0003]米氏方程V=Vmax [S]/(Km+[S])是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V (有些资料中也称为Vo)与底物浓度[S]关系的方程，此方程中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，代表了酶与底物的结合能力，是酶重要的特征参数之一，Km值等于酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。通常通过米氏方程转化得到的双倒数方程l/V=Km/(Vmax [S])+l/Vmax能够测定脲酶的Km值。具体方法是通过酶促反应速率的倒数I/ V对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图，得到直线在X轴上的截距为-1/Km，从而可以进一步计算得到Km的值。
[0004]脲酶米氏常数的测定是高等院校生物化学和应用酶学等课程经常开设的实验项目之一，也是对脲酶进行研宄的必要手段，米氏常数的测定受多种因素的影响，比如底物浓度、测试时间及酶浓度等，如果测试条件不合适，测得的数据会与实际值相差比较大。目前测定脲酶米氏常数一般采用脲酶-靛酚法，该方法步骤多、测试时间长。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种脲酶Km值测定方法即脲酶-酚红法，此方法具有步骤少、快速、准确的特点。
[0006]本发明所提供的测试方法原理是:以一系列不同浓度的尿素为底物，酚红为指示剂，在脲酶的作用下，尿素分解产氨，PH值上升，在酚红指示剂的作用下，体系的颜色变深，吸光度增加，吸光度的增加与酶促反应速度成正比，以吸光度的增加代表反应速度，通过双倒数方程，求得脲酶Km值。本发明对脲酶Km值测试涉及到的底物浓度、测试时间及酶浓度等条件进行了优化，确定了一种新的脲酶Km值测试方法。
[0007]本发明的技术方案:取96孔板，每孔分别加25μ?巨豆脲酶(10kU/L)，200μ?磷酸缓冲液(ΡΗ6.8，含不同浓度的尿素、酚红0.002%)，用分光光度计或酶标仪测吸光度。酶促反应速率与吸光度值的增加成正比，因此可以用吸光度增加值的倒数I/ Λ A代替双倒数方程中的1/V，对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图，根据双倒数方程l/v=Km/ (Vmax [S] )+1/Vmax可得直线在X轴上的截距即为-1/Km，求得Km值。
[0008]利用本发明测试方法，测得脲酶Km值为0.025-0.027mol/L,与文献报道值0.025mol/L非常接近，说明构建的测定脲酶Km值方法可行。
[0009]通过以下实施例进一步详细说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的限制。
[0010]实施例1
(I)脲酶溶液(10kU/L)配制:根据酶的活力单位数，称取一定量的酶粉，溶解与去离子水中，配成10kU/L的脲酶溶液。
[0011](2) pH值6.8的磷酸缓冲液的配制:取0.2mol/L磷酸二氢钠510ml，与0.2mol/L磷酸氢二钠490ml混合，加入0.02g酚红，搅拌溶解。
[0012](3)不同浓度的尿素缓冲液(pH=6.8)配置:取上述(2) pH值6.8的磷酸缓冲液10mL,加入尿素0.12克，得到含尿素20mmol/L的缓冲液，并以此溶液为母液，用上述(2)pH值6.8的磷酸缓冲液进行稀释，得到尿素浓度分别为20、15、10、6.67、5、4 mmol/L的磷酸缓冲液。
[0013](4)加样:取96孔板，每孔分别加25μ?巨豆脲酶(10kU/L)，200μ?上述(3)配置的磷酸缓冲液(尿素浓度分别为20、15、10、6.67、5、4 mmol/L)，每个浓度梯度至少做3个重复。
[0014](5)测试:加完样后立即用酶标仪测吸光度，记为A初始，之后每隔I分钟测I次吸光度，连续测30分钟左右，记录每个时间点的吸光度值Α，Δ A=A-A初始。
[0015](6)作图及数据计算:每个时间点均按照双倒数方程I/ Λ A =Km/ (Vmax[S] ) +1/Vmax,以I/ Λ A对底物尿素浓度的倒数1/[S]作散点图，得到一系列双倒数曲线及对应的线性方程。选取相关系数大于98%的曲线及其方程，求得其在X轴上的截距即-1/Km，并进一步求得Km值。
[0016]实际测试发现，用10-30分钟的数据计算得到的双倒数曲线对应的线性方程相关系数R2值均大于98%，计算得到的脲酶Km值为25-27 mmol/L，与文献报道值25 mmol/L非常接近，这说明用本发明提供的方法测定脲酶米氏常数是可行的。
[0017]本发明的测试方法具有简单、快速、准确的特点。
【主权项】
1.一种脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:以一系列不同浓度的尿素为底物，酚红为指示剂，脲酶分解尿素产氨，PH值上升，在酚红指示剂的作用下，体系的颜色变深，吸光度的增加，吸光度的增加与酶促反应速度成正比，以吸光度的增加代表反应速度，用吸光度增加值的倒数I/ Λ A代替双倒数方程中的1/V，对底物尿素浓度的倒数I/ [S]作图，根据双倒数方程l/V=Km/ (Vmax [S] ) +1/Vmax可得直线在X轴上的截距即为-1/Km，求得Km值。
2.—种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:配制的脲酶溶液活力单位为10kU/L左右。
3.—种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:使用系列浓度梯度的尿素缓冲溶液为底物，尿素浓度为4-20mmol/L，一般浓度设置为4、5、6.67、10、15和20mmol/L。
4.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:各种不同浓度的尿素溶液均以pH值6.8的磷酸缓冲液的配制。
5.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:缓冲液以酚红卫指示剂，含酚红0.002%。
6.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:反应体系里加一定量的脲酶溶液和上述权利要求3-5所述的尿素缓冲液。
7.以96孔板为例，每孔分别加25μ?巨豆脲酶(10kU/L)，200μ?尿素缓冲溶液(尿素浓度分别为4、5、6.67、10、15、20mmol/L的)，每种浓度的尿素至少三个重复。
8.—种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于:连续多次测定体系的吸光度，对于每个时间点的吸光度，均按照双倒数方程I/V =Km/ (VmaX[S])+l/VmaX，以吸光度的增加Λ A代表反应速度，用吸光度增加值的倒数I/Λ A代替双倒数方程中的1/V，对底物尿素浓度的倒数1/[S]作散点图，得到一系列双倒数曲线及对应的线性方程，选取相关系数大于98%的曲线及其方程，求得其在X轴上的截距即-1/Km，进一步计算得到Km值。
【专利摘要】本发明涉及一种脲酶米氏常数测试方法即脲酶-酚红法，属于生物化学和应用酶学技术领域。本发明所提供的测试方法是以一系列不同浓度的尿素溶液为底物，酚红为指示剂，在脲酶的作用下，尿素分解产氨，pH值上升，在酚红指示剂的作用下，体系的颜色变深，吸光度增加，用分光光度计或酶标仪测吸光度。酶促反应速率与吸光度值的增加成正比，因此可以用吸光度增加值的倒数1/△A代替双倒数方程1/V=Km/（Vmax[S]）+1/Vmax中的1/V，对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图，根据双倒数方程可得直线在X轴上的截距即为-1/Km，求得Km值。
【IPC分类】G01N21-78
【公开号】CN104697990
【申请号】CN201510004502
【发明人】盛桂华, 陈相飞, 胡晓明, 徐英, 韩艳伟, 陈杰, 王峰, 朱海亮
【申请人】山东理工大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年1月6日