高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于共焦显微成像技术和质谱成像技术领域，将激光共焦显微成像技术与质谱成像技术相结合，涉及一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置，可用于生物质谱成像领域的高分辨成像。
技术背景
[0002]质谱仪(Mass Spectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。
[0003]自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域一生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研宄的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研宄提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。
[0004]但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题:
[0005]I)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；
[0006]2)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移冋题。
[0007]而生物样品“微区”质谱信息的准确获取对于生命科学研宄具有极其重要的意义。事实上，目前如何高灵敏地探测微区质谱信息是生物质谱领域亟待研宄的重要技术问题。
[0008]激光共焦显微镜“点照明”和“点探测”的成像探测机制，不仅使其横向分辨力较同等参数的光学显微镜改善1.4倍，而且还使共焦显微镜极便于与超分辨光瞳滤波技术、径向偏振光紧聚焦技术等结合来压缩聚焦光斑，进一步实现高空间分辨显微成像。
[0009]基于此，本发明提出一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置，其将激光共焦显微镜聚焦光斑的探测功能与激光聚焦解吸电离功能相融合，利用经超分辨技术处理的共焦显微镜的微小聚焦光斑对样品进行高空间分辨成像，利用共焦显微镜同一聚焦光斑对样品进行解吸电离供质谱探测系统进行成像，继而实现被测样品微区的高空间分辨图像成像和高空间分辨质谱显微成像。
[0010]本发明提出一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置可为生物质谱高分辨成像提供一个全新的有效技术途径。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是为了提高质谱显微成像技术的空间分辨力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测样品成分空间信息和功能信息。
[0012]本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
[0013]本发明的一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法，是利用高空间分辨共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用高空间分辨共焦显微系统的同一聚焦光斑对样品进行解吸电离来进行质谱成像，进而实现样品微区图像与组分的高空间分辨成像，包括以下步骤:
[0014]步骤一、使平行光束通过环形光发生系统后整形为环形光束，该环形光束再经分光镜、中孔反射镜反射进入中孔测量物镜并聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽；
[0015]步骤二、使计算机控制由中孔测量物镜、轴向物镜扫描器、中孔反射镜、分光镜、集光透镜和光强点探测器构成的激光共焦探测系统通过轴向物镜扫描器对被测样品进行轴向扫描测得共焦轴向强度曲线；
[0016]步骤三、将共焦轴向强度曲线沿z向平移s后得到移位共焦轴向强度曲线，然后将移位共焦轴向强度曲线与共焦轴向强度曲线相减处理得到错位相减共焦曲线；
[0017]步骤四、将错位相减共焦曲线的零点位置zA减去平移值s/2得(z a-s/2)，计算机依据(za-s/2)值控制轴向物镜扫描器使中孔测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上；
[0018]步骤五、利用电离样品吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息;
[0019]步骤六、利用由中孔测量物镜、轴向物镜扫描器、中孔反射镜、分光镜、集光透镜和位于激光透镜焦点的光强点探测器构成的激光共焦探测系统对中孔测量物镜聚焦到被测样品的微区进行成像，测得对应聚焦光斑区域的形态信息；
[0020]步骤七、计算机将激光共焦探测系统测得的激光聚焦微区形态信息与质谱探测系统同时测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的形态和质谱信息；
[0021]步骤八、计算机控制二维工作台使中孔测量物镜对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二?步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息；
[0022]步骤九、重复步骤八直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机进行处理即可得到被测样品形态信息和质谱信息。
[0023]本发明高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法中，包括步骤一可以为使平行光束通过矢量光束发生系统、分光镜和光瞳滤波器后整形为环形光束，该环形光束再经中孔反射镜反射进入中孔测量物镜并聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。
[0024]本发明高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法中，包括步骤四可以为计算机依据共焦轴向强度曲线最大值M对应的位置zB值来控制轴向物镜扫描器使中孔测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上。
[0025]本发明高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法中，包括步骤八可以为计算机控制二维扫描振镜系统使中孔测量物镜对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二?步骤七进行操作，得到下一个待测聚焦区域的形态和质谱信息。
[0026]本发明的一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置，包括激光点光源系统、沿光束行进方向放置的准直透镜、产生环形光束的环形光发生系统、分光镜、中孔反射镜和聚焦中孔反射镜反射光束到被测样品的中孔测量物镜，还包括用于探测中孔测量物镜聚焦光斑反射光强度信号的集光透镜和位于集光透镜焦点的光强点探测器，以及用于探测中孔测量物镜聚焦光斑解析电离的离子体羽组分的电离样品吸管和质谱探测系统。
[0027]本发明的一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置中，包括环形光发生系统可用沿光轴方向放置的产生矢量光束的矢量光束发生系统和光瞳滤波器替代。
[0028]本发明的一种高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置中，包括激光点光源系统可以由脉冲激光器、聚焦透镜和位于聚焦透镜焦点的针孔构成。
[0029]有益效果
[0030]本发明对比已有技术，具有以下优点:
[0031]I)将具有高空间分辨能力的共焦显微技术与质谱探测技术相融合，使共焦显微成像系统的光斑实现聚焦探测和样品解析电离双重功能，可实现样品微区质谱的高空间质谱显微成像；
[0032]2)利用错位相减共焦曲线的过零点进行样品预先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到样品表面，可实现样品微区高空间分辨质谱探测和微区显微成像，有效地发挥共焦系统高空间分辨的潜能；
[0033]3)利用错位相减共焦曲线过零点进行样品预先定焦处理，可抑制现有质谱仪因长时间质谱成像中聚焦光斑相对被测样品的漂移问题；
[0034]4)利用环形光束成像既压缩了聚焦光斑的尺寸大小，又为质谱探测提供了结构方面的最佳融合，可提高激光质谱仪的空间分辨能力。
【附图说明】
[0035]图1为高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法示意图；
[0036]图2为高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法变换示意图1 ;
[0037]图3为高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置示意图；
[0038]图4为实施例1和2的高空间分辨激光共焦质谱显微成像方法与装置图；
[0039]图5为实施例3和4的高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置图；
[0040]其中:1-平行光束、2-光强点探测器、3-环形光发生系统、4-环形光束、5-分光镜、6-中孔反射镜、7-中孔测量物镜、8-被测样品、9-等离子体羽、10-计算机、11-轴向物镜扫描器、12-集光透镜、13-探测针孔、14-光强探测器、15-共焦轴向强度曲线、16-移位共焦轴向强度曲线、17-错位相减共焦曲线、18-电离样品吸管、19-质谱探测系统、20-二维工作台、21-矢量光束发生系统、22-光瞳滤波器、23-环形光束、24-激光点光源系统、25-准直透镜、26-脉冲激光器、27-聚焦透镜、28-针孔、29-出射光束衰减器、30-探测光束衰减器、31-二维扫描振镜系统。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0042]本发明的核心方法与装置如图1和3所示，其中，由环形光发生系统3和中孔测量物镜7构成的环形光横向超分辨系统，用于压缩聚焦光斑横向尺寸。
[0043]如图3所示，可以由点光源系统24出射的激光经准直物镜25准直后生成图1所示的平行光束I。
[0044]如图2所示，可以由矢量光束发生系统21、光瞳滤波器22替代图1中的环形光发生系统3，由矢量光束发生系统21、光瞳滤波器22和中孔测量物镜7构成的径向偏振光纵向场紧聚焦系统用于压缩聚焦光斑横向尺寸。
[0045]以下实施例均是在图1和3基础上实现的。
[0046]实施例1
[0047]本发明实施例基于图4所示的高空间分辨激光共焦质谱显微成像装置，包括由脉冲激光器26、聚焦透镜27和位于聚焦透镜27焦点的针孔28构成的激光点光源系统24，沿光轴方向放置的准直透镜25、出射光束衰减器29、环形光发生系统3、分光镜5、中孔反射镜6和位于光轴折反方向并聚焦中孔反射镜6反射光束到被测样品8的中孔测量物镜7，还包括由探测光束衰减器30、集光透镜12、位于激光透镜12焦点处的光强点探测器2构成的共焦光强探测系统，以及用于探测中孔测量物镜7聚焦光斑解析电离的等离子体羽9组分的电离样品吸管18和质谱探测系统19。其中点探测器2可由探测针孔13和光强探测器14构成。
[0048]由激光点光源系统24 (包括脉冲激光器26、聚焦透镜27和针孔28)、准直透镜25、环形光发生系统3、分光镜5、中孔反射镜6、轴向物镜扫描器11和中孔测量物镜7构成的激光聚焦系统用于产生超过衍射极限的微小聚焦光斑，该超衍射微小尺寸光斑具有测量样品表面和产生表面等离子体的双重功能。