专利名称：利用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产物的方法
技术领域：
本发明涉及利用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产物的方法。
背景技术：
毛莨科乌头属植物附子，川乌和草乌是常用的中药材，具有强心，止痛及消炎等多 种药理活性，同时也具有一定毒性。乌头碱是其中的主要有效成分和毒性成分之一。由于中 药一般多为口服用药，其有效成分在到达吸收的靶器官之前，在肠道内均会受到肠内菌群 的作用。乌头碱能够在肠内菌群的作用下代谢为单酯型生物碱，双酯型生物碱及脂类生物 碱。(赵宇峰等，高等学校化学学报Vol. 28 (11) ，2007， 2051-2055)现代药理学研究证明， 双酯型生物碱活性较强，但毒性也较大。脂型生物碱具有镇痛，消炎等显著的生物活性，与 双酯型生物碱比较，其毒性较小，是一类具有广泛药理活性的化学成分，具有重要的研究价 值和广阔的应用前景。由于乌头碱的体外代谢过程极其复杂，代谢产物种类繁多，因此要求 有一种快捷且准确的方法对代谢产物予以分析。
发明内容
本发明是利用基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)检测乌头碱体外代谢产物的方 法。本发明方法可对乌头碱体外代谢产物予以快速准确的分析。 利用基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)检测乌头碱体外代谢产物的方法，步骤 和条件如下 将0. 5 1. 5毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌培 养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养4 7日，取100 200微升培养液以1毫升 二氯甲烷萃取，二氯甲烷萃取液以3000 5000转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微
米微孔滤膜过滤后，上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为i : o.5 i : 2，所获得
的混合液利用基质辅助激光解吸质谱进行分析； 所述的基质为如下方法得到的(l)取a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA) 2 3毫 克，加入到200 300微升的乙腈和水的体积比为3 : 7 7 : 3的混合溶剂中，最后加入 8 IO微升三氟乙酸；或者， (2)取2，5-二羟基苯甲酸(DHB)2 3毫克，加入到200 300微升的乙腈和水的 体积比为3 : 7 7 : 3的混合溶剂中，最后加入8 10微升三氟乙酸。
有益效果本发明提供的的利用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产 物的方法，经基质辅助激光解吸质谱分析后表明，乌头碱(质谱中的相对质荷比为m/z 646)经体外代谢后可得到以下十八种代谢产物，包括单酯型生物碱去乙酸乌头碱(m/z 586)，苯甲酰乌头原碱(m/z 604);双酯型生物碱去氧乌头碱(m/z 630) ， 16_0_去甲基乌 头碱(m/z 632)，10-0H-乌头碱(m/z 662);脂类生物碱8-丙酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 660) ， 8- 丁酰-苯甲酰乌头原碱(m/z674) ， 8-戊酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 688) ， 8 (3-羟基)-丁酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 690)，8-己烯酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 700)，8_己 酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 702)，8-十四烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z814)，8-十五烷酰-苯 甲酰乌头原碱(m/z 828)，8-十六烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 842) ， 8-十七碳烯酰-苯甲 酰乌头原碱(m/z 854)，8-甲基十六烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 856) ， 8-十八碳烯酰-苯 甲酰乌头原碱(m/z 868)，8-十八烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 870)。实验结果表明，利用 基质辅助激光解吸质谱分析乌头碱代谢产物的方法具有简单易行，高效准确的特点。
图l是实施例l的质谱谱图。图中质荷比604(苯甲酰乌头原碱)为典型的单酯 型生物碱，质荷比630 (去氧乌头碱)为典型的双酯型生物碱，质荷比700 (8-己烯酰-苯甲 酰乌头原碱)为典型的脂类生物碱。
具体实施例方式
实施例1 :将0. 5毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌 培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养4日，取100微升培养液以1毫升二氯甲烷萃 取，二氯甲烷萃取液以3000转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤后， 上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : 0.5，所获得的混合液利用基质辅助激光 解吸质谱进行分析。 基质为a -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA) 2毫克，加入200微升乙腈和水的体积比 为3 : 7的混合溶剂中，最后加入8微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物，包括单酯型生物碱去乙酸 乌头碱(m/z 586)，苯甲酰乌头原碱(m/z 604);双酯型生物碱去氧乌头碱(m/z 630)， 16-0-去甲基乌头碱(m/z 632)，10-0H-乌头碱(m/z 662);脂类生物碱8-丙酰-苯甲 酰乌头原碱(m/z660)，8-丁酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 674) ， 8-戊酰-苯甲酰乌头原碱 (m/z 688)，8(3-羟基)-丁酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 690) ，8-己烯酰-苯甲酰乌头原 碱(m/z 700)，8-己酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 702) ， 8-十四烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/ z 814)，8-十五烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 828)，8-十六烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 842)，8-十七碳烯酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 854) ，8-甲基十六烷酰_苯甲酰乌头原碱(m/ z 856)，8-十八碳烯酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 868) ， 8-十八烷酰-苯甲酰乌头原碱(m/z 870)。 实施例2 :将1. 5毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌 培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养7日，取200微升培养液以1毫升二氯甲烷萃 取，二氯甲烷萃取液以5000转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤后， 上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : 2，所获得的混合液利用基质辅助激光解 吸质谱进行分析。 基质为a -氰基_4_羟基肉桂酸(CHCA) 3毫克，加入300微升乙腈和水的体积比
为7 : 3的混合溶剂中，最后加入IO微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物(同实施例1)。 实施例3 :将1毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养5日，取150微升培养液以1毫升二氯甲烷萃 取，二氯甲烷萃取液以3500转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤后， 上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : l，所获得的混合液利用基质辅助激光解 吸质谱进行分析。 基质为a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA) 2. 5毫克，加入250微升乙腈和水的体积
比为l : 1的混合溶剂中，最后加入9微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物(同实施例1)。 实施例4 :将0. 85毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧
菌培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养6日，取120微升培养液以1毫升二氯甲
烷萃取，二氯甲烷萃取液以3600转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤
后，上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : 0.8，所获得的混合液利用基质辅助
激光解吸质谱进行分析。 基质为2，5-二羟基苯甲酸(DHB)2.2毫克，加入220微升乙腈和水的体积比为 3 : 7的混合溶剂中，最后加入8微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物(同实施例1)。 实施例5 :将1. 2毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌
培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养7日，取100微升培养液以1毫升二氯甲烷萃
取，二氯甲烷萃取液以4500转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤后，
上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : l，所获得的混合液利用基质辅助激光解
吸质谱进行分析。 基质为2，5-二羟基苯甲酸(DHB)3毫克，加入300微升乙腈和水的体积比为7 : 3 的混合溶剂中，最后加入10微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物(同实施例1)。 实施例6 :将1. 4毫克乌头碱放入10毫升含有0. 2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌
培养基(GAM培养基)中，37t:厌氧条件下培养5日，取200微升培养液以1毫升二氯甲烷萃
取，二氯甲烷萃取液以4000转/分钟速率离心，所得上清液经0. 45微米微孔滤膜过滤后，
上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1 : 0.6，所获得的混合液利用基质辅助激光
解吸质谱进行分析。 基质为2，5-二羟基苯甲酸(DHB)2.7毫克，加入270微升乙腈和水的体积比为 1 : 1的混合溶剂中，最后加入9微升三氟乙酸。 经质谱检测，得到乌头碱的十八种体外代谢产物(同实施例1)。
权利要求
利用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产物的方法，步骤和条件如下将0.5～1.5毫克乌头碱放入10毫升含有0.2克健康大鼠粪便的普通厌氧菌培养基中，37℃厌氧条件下培养4～7日，取100～200微升培养液以1毫升二氯甲烷萃取，二氯甲烷萃取液以3000～5000转/分钟速率离心，所得上清液经0.45微米微孔滤膜过滤后，上清液与基质混合，上清液与基质的体积比为1∶0.5～1∶2，所获得的混合液利用基质辅助激光解吸质谱进行分析；所述的基质为如下方法得到的(1)取α-氰基-4-羟基肉桂酸2～3毫克，加入到200～300微升的乙腈和水的体积比为3∶7～7∶3的混合溶剂中，最后加入8～10微升三氟乙酸；或者，(2)取2，5-二羟基苯甲酸2～3毫克，加入到200～300微升的乙腈和水的体积比为3∶7～7∶3的混合溶剂中，最后加入8～10微升三氟乙酸。
全文摘要
本发明提供了利用基质辅助激光解吸质谱检测乌头碱体外代谢产物的方法。该方法将乌头碱加入含有健康大鼠新鲜粪便的普通厌氧菌培养基中培养一周，得到培养液，培养液以二氯甲烷萃取，二氯甲烷萃取液经离心，上清液经过微孔滤膜过滤后，利用基质辅助激光解吸质谱分析其中的乌头碱体外代谢产物。该方法分析出了18种乌头碱的体外代谢产物，具有简单易行，快速高效的特点。
文档编号G01N27/64GK101710097SQ20091021794
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者刘志强, 刘淑莹, 宋凤瑞, 王曦烨 申请人:中国科学院长春应用化学研究所