二硫化钼/纳米银复合物作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用
【专利摘要】本发明公开了二硫化钼/纳米银复合物作为基质在基质辅助激光解吸电离(MALDI)飞行时间质谱检测中的应用。首先通过改进的化学锂离子插层剥离法制备得到寡片层的二硫化钼，并在此基础上通过原位还原硝酸银制备得到二硫化钼/纳米银复合物。以该复合物作为MALDI基质的分析方法适用于对分子量小于1000的小分子进行质谱分析。适合的分子种类包括氨基酸、寡肽、脂肪酸、生物碱、激素、抗生素、抗菌药和抗癌药物等。采用本方法检测质荷比值(m/z)小于1000的分子时，不存在基质背景干扰现象。本方法可在有机与生物质谱、质谱成像、蛋白质谱学、代谢组学、生物标记物发现和环境分析等领域得到有效的应用。
【专利说明】
二硫化钼/纳米银复合物作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用
技术领域
[0001]本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质在小分子检测中的应用。
【背景技术】
[0002]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-TOFMS)技术在多肽、蛋白和寡糖等生物分子的分析中已成为一项有用的技术。然而用于mald1-tof MS的有机小分子基质虽然种类繁多，却很难用于小分子量(100Da以下)化合物的分析，主要原因在于有机小分子基质会发生碎裂及分子之间的缔合，从而产生严重的基质背景干扰现象。其次，待测物与基质混溶存在不均匀的共结晶现象，影响质谱信号的重复性。
[0003]为了避免基质背景干扰现象的产生，研究者们开发出一些新型的基质用于小分子量物质的分析。一些具有不同形貌和物质组成的纳米材料，如硅、金属、金属氧化物和碳材料等先后被引入以克服传统有机基质的背景干扰问题。即便如此，这些纳米材料仍存在着不足，大部分金属氧化物和碳基材料在水中分散性较差，使得在质谱检测时信号重复效果不好。此外，一些纳米材料繁琐的组装过程耗时较长，很大程度上限制了纳米材料作为基质在质谱检测中的应用。
[0004]研究者们也将纳米材料进行功能化以获得灵敏且重复性好的质谱结果。邓春晖等(C.Y.Shi1C.H.Deng,X.M.Zhang,P.Y.Yang,ACS Appl.Mater.1nterfaces 5(2013)7770-7776.)制备了水分散性好的聚多巴胺修饰的碳纳米管复合材料，解决了碳纳米管因水分散性差导致的靶点信号不稳定问题;吴仁安等(6.1111，5.入1^11，1^61^，1.?.1^，1?^.数1，ACS Appl.Mater.1nterfaces 7(2015)2032-2038.)制备了金纳米粒子为内核、介孔娃碳复合结构为外壳的核壳型纳米材料，在紫外区域对光的吸收更强，实现待测化合物的高效激光解吸离子化。然后这些复合材料均在正离子模式下进行检测，往往会得到除加氢峰以外的多重碱金属加和峰，增加了图谱的复杂度，而负离子模式则能得到更清晰且易分辨的去质子峰图谱。
[0005]因此，寻找一种操作制备简单，水分散性好，灵敏度高，且在检测范围内没有背景干扰的基质，对当前MALD1-TOF MS分析具有重要的实用意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种二硫化钼/纳米银复合物作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0008]二硫化钼/纳米银复合物(MoS2/Ag)作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用在本发明的保护范围之内。
[0009]其中，所述的二硫化钼/纳米银复合物按如下步骤制备得到:
[0010](I)氮气保护、100-300°c (优选100°C)条件下，二硫化钼粉末和正丁基锂反应3-6h(优选4h)，冷却至室温；
[0011](2)将步骤(I)得到的反应体系在氮气保护、25-60°C (优选25°C)条件下反应5-14处(优选4811);
[0012](3)将步骤(2)得到的反应体系减压抽滤，用正己烷洗涤I?3次，再置于去离子水中超声0.5-8h(优选4h)，离心后取上清液，得到浓度为0.05-0.5g/L的二维层状二硫化钼水溶液；
[0013](4)取柠檬酸三钠水溶液、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、硝酸银水溶液和硼氢化钠水溶液加入到步骤(3)所得溶液中，使它们的质量比为二硫化钼:柠檬酸三钠:聚乙烯吡咯烷酮:硝酸银:硼氢化钠=(0.1-10): (5-50): (50-200): (0.1-5): (0.1_5)，混合均匀，静置(优选静置24h)后得二硫化钼/纳米银复合物水溶液。
[0014]步骤(I)中，二硫化钼粉末和正丁基锂的反应摩尔比为0.1-2:1，优选0.4:1。
[0015]步骤(4)中，优选的质量比为二硫化钼:柠檬酸三钠:聚乙烯吡咯烷酮:硝酸银:硼氢化钠= 1.6: 19-20:90:1-1.05:0.9-lo
[0016]二硫化钼/纳米银复合物作为基质在小分子量化合物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0017]其中，所述的小分子量化合物是指分子量为1000以下的化合物，优选分子量为500以下的化合物。
[0018]其中，所述的小分子量化合物为氨基酸、寡肽、脂肪酸、生物碱、激素、抗生素、抗菌药和抗癌药物等。
[0019]本发明方法适合分析的样品除纯品和简单混合物外，还涵盖复杂混合体系，包括血清、尿液、以及环境监测样本，如水、大气、土壤样本等。
[0020]当以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质时，对基质溶液的浓度没有特别限定，通常可配制成0.lg/L至10g/L的浓度，溶剂为水。
[0021]具体的，在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中，待测样品溶液与基质溶液优选的用量比例为(0.01-10)mM:(0.1-10)g/L。
[0022]具有应用方式可以选择，将基质溶液0.5-lyL点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层，再取0.5-UiL的样品溶液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
[0023]具有应用方式也可以选择，先取0.5-lyL的样品溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，再将基质溶液0.5-lyL点样于样品点上，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
[0024]具有应用方式还可以选择，将样品溶液和基质溶液均匀混合，直接取0.5_2yL混合溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
[0025]本发明以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的质谱分析法，通常是用时间飞行质谱(TOF-MS)作为质量分析手段，但与其他质谱质量分析器也兼容。
[0026]本发明首先通过改进的化学锂离子插层剥离法制备得到寡片层的二硫化钼，并在此基础上通过原位还原硝酸银制备得到二硫化钼/纳米银复合物。以该复合物作为MALDI基质的分析方法适用于对分子量小于1000的小分子进行质谱分析。
[0027]本发明发展了以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的方法，从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量范围的基质背景干扰问题，保证了高灵敏度和高重现性的MALDI质谱分析。本发明的有益效果在于:所提供的二硫化钼/纳米银复合物的合成方法简单，复合材料由于纳米银表面的电荷作用而具有更好的水分散性。该材料以二维片层二硫化钼为骨架，有大的比面积和光吸收能力。由于二硫化钼和纳米银的协同效应，该复合材料能协同将吸收的能量传递给待测物，提高待测物的激光解吸离子化效率。具有较强的抗盐干扰能力，因而对多种复杂混合体系无需特殊复杂处理即可分析。
【附图说明】
[0028]图1为二硫化钼/纳米银复合物的透射电子显微镜照片；
[0029]图2为二硫化钼/纳米银复合物在水中分散性的照片；
[0030]图3为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的组氨酸、苯丙胺酸、精氨酸、色氨酸混合溶液在负离子模式下的质谱分析图；
[0031]图4为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的含盐组氨酸溶液在负离子模式下的质谱分析图；
[0032]图5为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的寡肽Gly-Gly、Ala-Ala、Ala-Gln、Try-Phe、Gla-Val -Phe混合溶液在负离子模式下的质谱分析图；
[0033]图6为以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为MALDI基质的寡肽Gly-Gly、Ala_Ala、Ala-Gln、Try-Phe、Gla-Val_Phe混合溶液在正离子模式下的质谱分析图；
[0034]图7 为以 3-氨基喹啉(3-AQ)为 MALDI 基质的寡肽 Gly-GlyJla-AlaJla-GlruTry-phe 、Gla-Val -Phe混合溶液在负离子模式下的质谱分析图；
[0035]图8为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸混合溶液在负离子模式下的质谱分析图；
[0036]图9为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的血清中阿司匹林在负离子模式下的质谱分析图；
[0037]图10为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的血清中褪黑素在负离子模式下的质谱分析图；
[0038]图11为以二硫化钼/纳米银复合物为MALDI基质的尼罗替尼水溶液在负离子模式下的质谱分析图。
【具体实施方式】
[0039]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0040]实施例1:二硫化钼/纳米银复合物的合成。
[0041 ] (I)氮气保护下将0.019mol 二硫化钼粉末和0.0475mol的正丁基锂快速加入到50mL的聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱内100 °C加热反应4h，自然冷却至室温。
[0042](2)将步骤(I)的溶液快速转移至250mL的三颈瓶中，在氮气保护下，室温25°C反应48h0
[0043](3)将步骤(2)所得溶液快速减压抽滤，用200mL正己烷洗涤3次，再将抽滤得到的产品快速转移至一定量的去离子水中超声4h，离心离去未剥离好的二硫化钼，取上清液保存，最后测其浓度。
[0044](4)取16mL步骤(3)所得溶液(浓度为0.lg/L)，加入1.5mL柠檬酸三钠水溶液(浓度为12.9g/L)，1.5mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液(浓度为60g/L)，600yL硝酸银水溶液(浓度为1.7g/L)和48yUi氢化钠水溶液(浓度为18.9g/L)，混合搅拌10分钟后，静置24小时后即得所需产品二硫化钼/纳米银复合物水溶液。
[0045]图1为二硫化钼/纳米银复合物的透射电子显微镜照片；图2为二硫化钼/纳米银复合物在水中分散性的照片说明。可以看出，所合成的复合物材料能形成均匀的分散体系，具有很好的亲水性和稳定性。
[0046]实施例2:二硫化钼/纳米银复合物的合成。
[0047](I)氮气保护下将0.03mol二硫化钼粉末和30mL的正丁基锂(1.6M)快速加入到50mL的聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱内150 °C加热反应3h，自然冷却至室温。
[0048](2)将步骤(I)的溶液快速转移至250mL的三颈瓶中，在氮气保护下，40 °C反应24h。
[0049](3)将步骤(2)所得溶液快速减压抽滤，用200mL正己烷洗涤3次，再将抽滤得到的产品快速转移至一定量的去离子水中超声2h，离心离去未剥离好的二硫化钼，取上清液保存，最后测其浓度。
[0050](4)取30mL步骤(3)所得溶液(浓度为0.05g/L)，加入3mL柠檬酸三钠水溶液(浓度为12.9g/L)，0.9mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液(浓度为60g/L)，600yL硝酸银水溶液(浓度为1.7g/L)和96yL硼氢化钠水溶液(浓度为18.9g/L)，混合搅拌15分钟后，静置24小时后即得所需产品二硫化钼/纳米银复合物水溶液。
[0051 ]实施例3: 二硫化钼/纳米银复合物的合成。
[0052](I)氮气保护下将0.06mol二硫化钼粉末和40mL的正丁基锂(1.6M)快速加入到50mL的聚四氟乙烯的反应釜中，于烘箱内200 °C加热反应6h，自然冷却至室温。
[0053](2)将步骤(I)的溶液快速转移至250mL的三颈瓶中，在氮气保护下，50°C反应48h。
[0054](3)将步骤(2)所得溶液快速减压抽滤，用200mL正己烷洗涤3次，再将抽滤得到的产品快速转移至一定量的去离子水中超声8h，离心离去未剥离好的二硫化钼，取上清液保存，最后测其浓度。
[0055](4)取4mL步骤(3)所得溶液(浓度为0.5g/L)，加入2mL柠檬酸三钠水溶液(浓度为12.9g/L)，1.5mL聚乙烯吡咯烷酮水溶液(浓度为60g/L)，ImL硝酸银水溶液(浓度为1.7g/L)和0.5mL硼氢化钠水溶液(浓度为2g/L)，混合搅拌10分钟后，静置24小时后即得所需产品二硫化钼/纳米银复合物水溶液。
[0056]实施例4:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于氨基酸的分析。
[0057]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0058]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.5g/L的基质溶液。将基质溶液IyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的氨基酸混合溶液(浓度为0.5mM)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图3)。
[0059]实施例5:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于含盐氨基酸的分析。
[0060]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0061]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.5g/L的基质溶液。将基质溶液IyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。将精氨酸溶解在0.0lM的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为5μΜ的含盐精氨酸溶液。取IyL的含盐精氨酸溶液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图4)。
[0062]实施例6:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于寡肽的分析。
[0063]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0064]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.5mg/mL的基质溶液。将基质溶液IyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的寡肽混合溶液(浓度为0.5mM)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图5)。
[0065]称取1mg有机小分子基质CHCA，溶于ImL含0.1%三氟乙酸的乙腈/水(2:1，V/V)混合液中，得到10g/L CHCA基质溶液。取IyL的多肽混合溶液(浓度为0.5mM)点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干后，再取IyL的CHCA基质溶液点样于样品上并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图6)。称取1mg有机小分子基质3-AQ，溶于ImL乙腈/水(1:1，V/V)混合液中，得到10g/L 3-AQ基质溶液。取IyL的多肽混合溶液(浓度为
0.5mM)点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干后，再取IyL的3-AQ基质溶液点样于样品上并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图7)
[0066]由图6和图7可知，以传统的有机小分子基质作为MALDI基质在正、负离子模式下都会在低分子量范围内产生基质背景干扰现象。而以二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质，能有效去除基质在低分子量区域的干扰。
[0067]实施例7:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于脂肪酸的分析。
[0068]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0069]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.5g/mL的基质溶液。将基质溶液IyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的脂肪酸混合溶液(浓度为0.5mM)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析(图8)。
[0070]实施例8: 二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于腺苷溶液的分析。
[0071 ] 二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0072]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.lg/L的基质溶液。将基质溶液IyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取0.5yL的腺苷溶液(浓度为1mM)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
[0073]实施例9: 二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于阿莫西林溶液的分析。
[0074]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0075]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为5g/L的基质溶液。取5yL基质溶液和5yL阿莫西林溶液(浓度为0.5mM)混合均匀，再取混合液2yL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干后进行质谱分析。
[0076]实施例10:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于磺胺二甲基嘧啶溶液的分析。
[0077]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0078]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为10mg/mL的基质溶液。将基质溶液0.5yL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的磺胺二甲基嘧啶溶液(浓度为
0.1mM)点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
[0079]实施例11:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于血清中阿司匹林的分析。
[0080]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0081 ] 分别取20nmol的阿司匹林，溶解于20yL的人血清中。加入80yL乙腈震荡5分钟以沉淀血清中的高丰度蛋白，然后在14000转/分下离心15分钟，保留上清液。取基质(二硫化钼/纳米银复合物)溶液(浓度为0.5g/L)lyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的上述离心后的上清液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进入质谱分析(图9)。
[0082]实施例12:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于血清中褪黑素的分析。
[0083]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0084]分别取20nmol的褪黑素，溶解于20yL的人血清中。加入80yL乙腈震荡5分钟以沉淀血清中的高丰度蛋白，然后在14000转/分下离心15分钟，保留上清液。取基质(二硫化钼/纳米银复合物)溶液(浓度为0.5g/L)lyL点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层。再取IyL的上述离心后的上清液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进入质谱分析(图10)。
[0085]实施例13:二硫化钼/纳米银复合物作为MALDI基质用于尼罗替尼溶液的分析。
[0086]二硫化钼/纳米银复合物采用实施例1的方法合成。
[0087]取二硫化钼/纳米银复合物溶液，14000转/分下离心15分钟并用去离子水洗涤两次，重悬于去离子水中，得到浓度为0.5g/L的基质溶液。取IyL的尼罗替尼溶液(浓度为
0.5mM)点样于MALDI靶板，在室温下在空气中自然风干后，再将基质溶液IyL点样于样品点上，待干燥后进行质谱分析(图11)。
【主权项】
1.二硫化钼/纳米银复合物作为基质在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的二硫化钼/纳米银复合物按如下步骤制备得到: (1)氮气保护、100-300°C条件下，二硫化钼粉末和正丁基锂反应3-6h，冷却至室温； (2)将步骤(I)得到的反应体系在氮气保护、25-60°C条件下反应5-144h; (3)将步骤(2)得到的反应体系减压抽滤，用正己烷洗涤I?3次，再置于去离子水中超声0.5-8h，离心后取上清液，得到浓度为0.05-0.5g/L的二维层状二硫化钼水溶液； (4)取柠檬酸三钠水溶液、聚乙烯吡咯烷酮水溶液、硝酸银水溶液和硼氢化钠水溶液加入到步骤(3)所得溶液中，使它们的质量比为二硫化钼:柠檬酸三钠:聚乙烯吡咯烷酮:硝酸银:硼氢化钠=(0.1-10): (5-50): (50-200):(0.1-5):(0.1-5)，混合均匀，静置后得二硫化钼/纳米银复合物水溶液。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(I)中，二硫化钼粉末和正丁基锂的反应摩尔比为0.1-2:1。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，二硫化钼/纳米银复合物作为基质在小分子量化合物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的小分子量化合物是指分子量为1000以下的化合物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的小分子量化合物为氨基酸、寡肽、月旨肪酸、生物碱、激素、抗生素、抗菌药或抗癌药物。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测中，待测样品溶液与基质溶液的用量比例为(0.01-1 O )mM: (0.1 -1 O) g/L。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将基质溶液0.5-lyL点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，产生薄基质层，再取0.5-lyL的样品溶液点样于基质层并在室温下置于空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，先取0.5-lyL的样品溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，再将基质溶液0.5-lyL点样于样品点上，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将样品溶液和基质溶液均匀混合，直接取.0.5-2yL混合溶液点样于基质辅助激光解吸电离靶板，在室温下在空气中自然风干，待干燥后进行质谱分析。
【文档编号】G01N1/38GK105929017SQ201610415587
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】许丹科, 赵亚菊, 刘晓辉, 李慧, 孙亮
【申请人】南京大学