基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法
【专利摘要】基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法，步骤一、在常温常压条件下，先将溶剂注入纳升喷雾毛细管中，步骤二、将样品加载在溶剂的末端或溶剂的中间；施压直流电压在纳升喷雾毛细管，样品中的目标化合物便会溶解在加载溶剂中并向纳升喷雾毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为并被质谱检测器检测到相应的信号，得出分析结果；本发明具有操作简便、无需样品预处理、样品用量少、分析灵敏度高、可用于目标化合物的实时快速分析等特点。
【专利说明】基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新型的质谱电离源技术，特别涉及一种基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法。
技术背景
[0002]质谱分析由于具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、特异性强等特点，已广泛应用于各个领域目标化合物的定性和定量分析。为了进一步提高质谱分析的灵敏度、降低分析检测限，通常复杂样品分析前需经过繁琐的样品分离纯化等步骤对样品进行预处理，该过程不仅耗时、耗力，同时也不利于小体积生物样品的定性和定量分析。
[0003]为了简化复杂样品的分析过程，自1989年美国耶鲁大学的Fenn教授发明了电喷雾电离源技术【Science 246，64_71 (1989)】后，迄今已发展了不同类型的电离技术用于简化或去除质谱分析前样品的预处理过程。其中一个研究方向是发展新型的常压电离源技术。由于该技术具有操作简单、分析通量高、价格低廉、无需样品预处理等优点，现今已相继发展了不同的电离技术，如解吸电喷雾电离技术(Desorpt1n Electrospray1nizat1n, DESI) [Science 306，471-473 (2004)】,实时直接分析技术(Direct Analysisin Real Time, DART)【Anal.Chem.77, 2297-2302(2005)】、低温等离子体技术(LowTemperature Plasma, LTP)【Anal.Chem.77，229T7-23O2 (2OO5)】、纸喷雾电离源技术(PaperSpray 1nizat1n, PSI) [Angew.Chem.1nt.Edit.49, 877-880 (2010)】等。尽管这些技术已广泛应用于不同目标化合物的快速分析，然却由于这种方法灵敏度较低，不适合小体积样品的分析。纳升电喷雾电离源技术是一类有别于常压电离源的质谱电离技术，该技术由于样品用量少、分析流速低，具有较高的灵敏度，为小体积复杂样品的实时、直接分析提供了一种新途径。为了提高纳升电喷雾电离源技术在复杂样品分析方面的性能，2011年Huang等提出了一种诱导纳升电喷雾电离源技术【Angew.Chem.1nt.Edit.50, 9907-9910 (2011)】。该技术是将一脉冲式直流电压施加在纳升电喷雾电离毛细管的尖端，这种方法有效避免了电极与喷雾溶剂的直接接触，可直接对复杂样品基体(如血清、尿样、高浓度盐溶液等)中的目标化合物进行快速分析，最低定量限可达到2ng.mL—1。为了有效去除复杂样品中基体的干扰，2013年Wei等提出了一种阶梯电压纳升电喷雾电离技术【Angew.Chem.1nt.Edit.52，11025-11028(2013)】，该方法是先在纳升电喷雾毛细管上施加5.2kV的高压，持续时间为30秒，然后将电压调节至2.4kV对目标化合物进行分析。尽管这些方法对小体积复杂样品的快速分析起到了关键作用，但是它们并不能有效避免样品基体的干扰，从而不利于质谱分析灵敏度的提高。为此，发展可有效去除样品基质干扰的方法对小体积样品的高灵敏质谱分析将会起到至关重要的作用。
【发明内容】
[0004]为了克服上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法，该方法是基于有机溶剂对生物样品中强极性化合物较弱的溶解能力，有机溶剂可将生物基质中的目标化合物有效萃取出来并迁移至纳升毛细管的尖端发生电喷雾行为，而生物基体仍保留在原处的思想，采用该电离源技术可直接对小体积、复杂样品中的目标化合物进行快速、高灵敏度分析，可有效避免生物样品中基体对分析目标化合物的干扰，同时该方法具有操作简单、无需样品预处理、灵敏度高等特点。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0006]基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法，包括以下步骤:
[0007]步骤一、在常温常压条件下，先将溶剂注入纳升喷雾毛细管中，所采用的溶剂为有机溶剂，包括甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈，溶剂的体积为10-25 yL ;纳升喷雾毛细管包括石英毛细管、玻璃毛细管，纳升喷雾毛细管的尖端孔径大小可为10-50μπι ;
[0008]步骤二、将样品加载在溶剂的末端或溶剂的中间，样品的体积为1-5 μ L，样品为生物样品，包括血样、尿样或食品；施压直流电压在纳升喷雾毛细管，电压大小为1.5 -4.0kV ;样品中的目标化合物便会溶解在加载溶剂中并向纳升喷雾毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为并被质谱检测器检测到相应的信号，得出分析结果，质谱检测器为三重四极质谱仪或线性离子肼质谱仪。
[0009]本发明有如下优点:1、本电喷雾电离源技术可在常温、常压条件进行操作，具有操作简单、分析速度快等特点。2、本电喷雾电离源技术无需样品预处理。采用本电离源技术，可直接对复杂生物样品进行直接分析，无需复杂的样品纯化分离步骤。3、本电喷雾电离源技术灵敏度高。本电离源技术可有效去除样品基质对分析目标化合物的干扰，同时兼顾纳升电喷雾电离源灵敏度高的优点，促使该电离源技术对复杂样品中目标化合物分析具有较高的灵敏度。4、本电离源技术样品用量少。采用本发明的电离体系，所需分析样品的体积为微升级，甚至更低。5、本电离源技术可用于目标样品的实时快速分析。采用本发明装置，可对小体积复杂样品中的目标化合物进行实时快速分析。
[0010]本发明具有操作简便、无需样品预处理、样品用量少、分析灵敏度高、可用于目标化合物的实时快速分析等特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是将2 μ L含有I μ g.mL—1维拉帕米药物化合物的血样加载到注有20 μ L甲醇溶剂毛细管末端(毛细管尖端的孔径为20 μ m)喷雾前后血样位置的变化情况:图1A为喷雾前；图1B为喷雾后，喷雾电压为:2.0kV。
[0012]图2是将2 μ L含有I μ g.mL—1维拉帕米药物化合物的血样加载到注有20 μ L甲醇溶剂毛细管中间(毛细管尖端的孔径为20μπι)喷雾前后血样位置的变化情况:图2Α为喷雾前；图2Β喷雾后，喷雾电压为:2.0kV。
[0013]图3是将2 μ L含有I μ g.mL—1维拉帕米药物化合物的血样加载到注有20 μ L甲醇溶剂毛细管末端，毛细管尖端的孔径分别为I μ m和20 μ m，喷雾一段时间后特征离子峰m/z 165峰强度的变化趋势:㈧毛细管的尖端为I μ m ;⑶毛细管的尖端为20 μ m ; (C)采用毛细管尖端孔径尺寸为Iym所得特征离子峰m/z 165的信号；(D)采用毛细管尖端孔径尺寸为20 μ m所得特征离子峰m/z 165的信号(喷雾电压为:2.0kV)。
[0014]图4是溶质迁移电喷雾电离源(AM-ESI)与纸喷雾电离源(PSI)分析灵敏度的比较(分析样品:含有不同浓度维拉帕米药物化合物0.05 -1OOOng.mL-1的血样；样品量:2yL;溶剂:20 μ L甲醇；溶质迁移电喷雾电压:2.0kV ;纸喷雾电压:3.5kV;溶质迁移电喷雾毛细管尖％5尺寸:15μπι)。
[0015]图5是溶质迁移电喷雾电离源对不同复杂生物样品分析的质谱图:图5Α为橄榄油，溶剂:20μ?甲醇；喷雾电压:+2.0kV);图5B为猪肝脏，溶剂:20μ?乙醇；喷雾电压:-2.0kV ;分析样品:采用注射器针头在猪肝脏表皮内4mm处取一定量体积的样品；图5C为黑发根，图为白发根溶剂:20 μ L甲醇；喷雾电压:+2.0kV ;分析样品:发根是从一志愿者头部直接取样。
[0016]图6是溶质迁移电喷雾电离源对不同食用植物油，包括芝麻油、橄榄油、花生油、玉米油和芥末油样品所得质谱图的PCA分析结果，溶剂:20μ L甲醇；喷雾电压:-1.5kV ;样品体积:2μ Lo
[0017]图7是本发明的装置及其步骤示意图。
【具体实施方式】
[0018]下面通过实施例详述本发明；但本发明并不限于下述的实施案例。
[0019]参照图7，基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法，包括以下步骤:
[0020]步骤一、在常温常压条件下，先将溶剂注入纳升喷雾毛细管中，所采用的溶剂为有机溶剂，包括甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈，溶剂的体积为10-25 yL ;纳升喷雾毛细管包括石英毛细管、玻璃毛细管，纳升喷雾毛细管的尖端大小为10-50 μ m ；
[0021]步骤二、将样品加载在溶剂的末端或溶剂的中间，样品的体积为l-5yL，样品为生物样品，包括血样、尿样或食品；施压直流电压在纳升喷雾毛细管，电压大小为1.5 -4.0kV ;复杂样品中的目标化合物便会溶解在加载溶剂中并向纳升喷雾毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为并被质谱检测器检测到相应的信号，得出分析结果，质谱检测器为三重四极质谱仪或线性离子肼等质谱仪。
[0022]实施例一
[0023]溶质迁移电喷雾电离源将分析样品加载在溶剂的末端
[0024]室温条件下，将20 μ L溶剂(甲醇)注入尖端孔径尺寸为20 μ m的毛细管，然后采用移液器将2 μ L含有目标药物化合物的血样加载在溶剂的末端。当施加2.0kV的直流电压后，血样中的药物化合物便会被溶剂萃取出来，并向毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为。在该过程中，血样基质不会随着溶剂的迁移而发生变化，具体过程如图1所示。图1A为当加入2 μ L血样后电喷雾毛细管的情况；图1B为当施加2.0kV直流电压在喷雾毛细管一段时间后，毛细管所拍图片，从中可看出，喷雾前后血样的位置基本保持不变。
[0025]实施例二
[0026]溶质迁移电喷雾电离源将分析样品加载在溶剂的中间
[0027]室温条件下，将20 μ L溶剂(如甲醇)注入尖端孔径尺寸为20 μ m的毛细管，然后采用移液器将2 μ L含有目标药物化合物的血样加载在溶剂的中间。当施加2.0kV的直流电压后，血样中的药物化合物便会被溶剂萃取出来，并向毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为。在该过程中，血样基质不会随着溶剂的迁移而发生变化，具体过程如图2所示。图2Α为当加入2 μ L血样后电喷雾毛细管的情况；图2Β为当施加2.0kV直流电压在喷雾毛细管一段时间后，毛细管所拍图片，从中可看出，喷雾前后血样的位置基本保持不变。
[0028]实施例三
[0029]毛细管尖端尺寸对溶质迁移电喷雾电离源的影响
[0030]室温条件下，将20 μ L溶剂(如甲醇)分别注入尖端孔径尺寸为I μ m和20 μ m的毛细管，然后采用移液器将2 μ L含有目标药物化合物如维拉帕米(浓度为I μ g.ml/1)的血样加载在溶剂的末端。当施加2.0kV的直流电压后，溶剂便会在毛细管的尖端发生电喷雾行为。在该过程中，采用尖端尺寸为Iym的毛细管，30min内观察不到明显的特征分子峰强度的变化(如图3A所示)；相反，当采用尖端尺寸为20 μ m的毛细管，经过大约2min左右的溶质迁移过程，目标药物化合物的质谱信号达到最高值(如图3B所示)。从中可看出，由于血样的位置基本保持不变(如图1A所示)，而血样中目标药物化合物的信号通过该过程的迁移达到最高值，说明分析化合物在毛细管中发生了溶质迁移，进而到达毛细管的尖端发生电喷雾行为，而血样由于与有机溶剂如甲醇较弱的溶解能力，其位置保持不变。
[0031]实施例四
[0032]溶质迁移电喷雾电离源具有较高的灵敏度
[0033]室温条件下，将20 μ L溶剂(如甲醇)注入尖端孔径尺寸为20μπι的毛细管，然后采用移液器将2μ L含有不同浓度目标药物化合物如维拉帕米(浓度介于0.05-1000ng.πιΓ1)的血样加载在溶剂的中间。当施加2.0kV的直流电压后，溶剂便会在毛细管的尖端发生电喷雾行为。通过对所得数据的总结分析，所得药物化合物特征碎片峰m/z 165的强度随维拉帕米浓度的变化曲线如图4所示，可看出，采用发展的迁移电喷雾电离技术对维拉帕米的最低定量限可达到0.5ng.mL—1。相反，在相同条件下，当采用纸喷雾电离技术[Angew.Chem.1nt.Edit.49, 877-880 (2010)】时，其最低定量限为 5ng.mL、由此可见，采用发展的溶质迁移电喷雾电离技术，其质谱分析的灵敏度提高了一个数量级。
[0034]实施例五
[0035]溶质迁移电喷雾电离源可用于各种复杂生物样品的快速分析
[0036]室温条件下，将20 μ L有机溶剂注入尖端孔径尺寸为20 μ m的毛细管，然后将不同生物样品如食用植物油、动物肾脏、头发样品等加载在溶剂的中间。当施加2.0kV的直流电压后，溶剂便会将复杂样品中的化合物溶解，并将其迁移到喷雾毛细管的尖端发生电喷雾行为。图5为不同复杂生物样品采用溶质迁移电喷雾电离源所得质谱图。
[0037]实施例六
[0038]溶质迁移电喷雾电离源可用于复杂生物样品的快速辨别
[0039]室温条件下，将20 μ L溶剂(如甲醇)注入尖端孔径尺寸为20 μ m的毛细管，然后采用移液器将2 μ L植物油加载在溶剂的末端。当施加-1.5kV的直流电压后，溶剂便会在毛细管的尖端发生电喷雾行为，通过质谱检测便会得到相应的质谱图。经过对质量范围为m/z 50-1200所有离子峰的PCA分析，所得五种植物油的PCA分析结果如图6所示。由图可看出，采用发展的溶质迁移电喷雾电离技术可有效辨别所选用的五种复杂植物油(芝麻油、橄榄油、花生油、玉米油和芥末油)。
【权利要求】
1.基于溶质迁移电喷雾电离技术的生物样品质谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、在常温常压条件下，先将溶剂注入纳升喷雾毛细管中，所采用的溶剂为有机溶齐U，包括甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈，溶剂的体积为10-25 μ L ;纳升喷雾毛细管包括石英毛细管、玻璃毛细管，毛细管的尖端孔径大小为10-50 μ m ； 步骤二、将样品加载在溶剂的末端或溶剂的中间，样品的体积为1_5μ L，样品为生物样品，包括血样、尿样或食品；施压直流电压在纳升喷雾毛细管，电压大小为1.5 - 4.0kV ;样品中的目标化合物便会溶解在加载溶剂中并向纳升喷雾毛细管的尖端迁移，进而发生电喷雾行为并被质谱检测器检测到相应的信号，得出分析结果，质谱检测器为三重四极质谱仪或线性离子肼质谱仪。
【文档编号】G01N27/64GK104316592SQ201410616034
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】张智平, 郑亚君, 张新荣 申请人:西安石油大学