使用激光喷雾电离的质谱法的制作方法

专利名称：使用激光喷雾电离的质谱法的制作方法
技术领域：
本文揭示用于使用激光喷雾电离(LSI)的质谱法的系统和方法。LSI可在大气压下产生多电荷离子以用于分析并且允许分析高分子量分子，包括超过4000道尔顿的分子。所述分析可以是基于溶剂或无溶剂分析。跟踪LSI的无溶剂分析允许改进的空间分辨率，其有利于组织成像和分析溶解度有限的化合物。相关串请案的交叉引用本申请案主张2009年6月3日申请的美国临时申请案第61/183，899号、2009年10月13日申请的美国临时申请案第61/251，247号、2009年10月16日申请的美国临时申请案第61/252，580号、2010年2月23日申请的美国临时申请案第61/307，352号和2010年5月26日申请的美国临时申请案第61/348，676号的权益，所述临时申请案以全文引用 的方式并入本文中。
背景技术：
基质辅助激光解吸/ 电离(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)是一种用于质谱法(MS)中的电离技术，其允许分析许多(生物)分子。所述(生物)分子的电离是通过激光触发，而基质是用于保护(生物)分子免受激光影响。适当基质材料一般具有低分子量并且常常呈酸性以提供质子源，优先产生带正电(生物)分子离子；基本基质材料也可用于优先提供带负电(生物)分子离子。基质材料在所用的激光波长下还具有良好光学吸收以使得其快速吸收激光照射。在这一过程期间还常常使用溶剂。表面成像可能非常适用于如检测癌症边界、确定药物摄取位置和在脑组织中定位信号传导分子或合成材料分析(聚合物组合物中的断裂)等多种领域。已充分建立通过MS进行成像，尤其使用次级离子质谱法(secondary ion mass spectrometry, SIMS),但SIMS仅勉强适用于完整生物组织。另一方面，MALDI MS已在用于组织成像方面获得一定的成功，尤其用于高丰度组分，诸如膜脂、药物代谢物和蛋白质。然而，使用所述基于真空的MALDIMS来进行组织成像，尤其对于纯的组织来说存在许多缺点。大气压(AP)-MALDI组织成像解决了真空MALDI的许多缺点，但因其在高空间分辨率下的敏感度问题而受限。重要的是，MALDI以作为一种主要产生单电荷离子以用于MS分析的电离方法而著称。然而，有效的MS仪器通常并不检测单电荷离子，因此AP-MALDI可能与高分辨率质谱仪不相容。使用溶剂的传统分析方法还产生许多缺点。举例来说，虽然目前使用的MALDI技术可用于分析一些(生物)分子，但对于通常不溶于常见溶剂中的许多(生物)分子(包括蛋白质)来说仍存在相当大的技术障碍。举例来说，诸如膜蛋白等一些蛋白质因为具有疏水性而不溶。另外，错误折叠的蛋白质具有暴露的疏水性区域并且可形成不溶性聚集体。许多重组蛋白质当在异源宿主中过表达时，会因为错误折叠而变得不溶或发展诸如阿兹海默氏病(Alzheimer, s Disease)等疾病状况。另外，在基于溶剂的MS样品制备中，会出现人为因素，诸如色氨酸和甲硫氨酸残基的氧化(科恩(Cohen)，分析化学(Anal. Chem.) 2006 ；78 =4352-4362 ；弗洛里希(Froelich)等人,蛋白质组学(Proteomics) 2008 ;8 :1334-1345)。这些人为因素可能在组合样品和基质的溶液的同一时段内产生。因此，基于溶剂的MS可能对于与了解氧化应激有关的应用并非最佳。MS在用于表征材料时存在这些缺点和其它缺点，这是因为其无法分析纯的、复杂的、电离延迟或溶解延迟材料。生物材料是一类所述复杂的材料。

发明内容
本发明提供通过质谱法(MS)改进材料分析和表面成像(包括组织成像)的系统和方法。所述系统和方法利用激光喷雾电离(LSI)方法，其产生更易通过MS仪器检测的许多多电荷离子，而非通过常规基质辅助激光解吸/电离(MALDI)产生的主要为单电荷的离子。在透射几何条件下对准的激光改进空间分辨率，这对于表面成像分析尤其重要。跟踪LSI的MS可以是基于溶剂或无溶剂分析。跟踪LSI的无溶剂分析避免了上文所述的与基 于溶剂的分析相关的许多缺点。无溶剂分析还允许改进的空间分辨率，其有利于MS表面成像。特定来说，本文所揭示的一实施例提供一种产生多电荷离子以用于分析材料的方法，其包含将所述材料和基质涂覆于表面作为材料/基质分析物；在大气压或接近大气压下用激光烧蚀所述材料/基质分析物；和使经激光烧蚀的材料/基质分析物穿过加热区域，随后材料/基质分析物进入质谱仪的高度真空区域。所产生的多电荷离子可以是正离子或负离子。在另一实施例中，所述基质由在激光波长下吸收能量的小分子构成。在另一实施例中，所述小分子是选自由二羟基苯甲酸和二羟基苯乙酮组成的群组。在另一实施例中，小分子是选自由以下组成的群组2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB ;酸性基质材料)；2，5_ 二羟基苯乙酮(2，5-DHAP) ;2，6_ 二羟基苯乙酮(2，6_DHAP) ;2，4，6_三羟基苯乙酮(2，4，6-THAP) ; a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA) ;2_氨基苯甲醇(2-ABA ;基本基质材料)；和/或具有类似位置官能团的其它小芳香族分子。在另一实施例中,激光在紫外区中具有输出功率。在另一实施例中,激光是氮气激光(337nm)或三倍频Nd/YAG激光(355nm)。在另一实施例中，所述加热区域是加热管。在特定实施例中，加热管由不会放出对质谱仪真空系统有害的蒸气的耐热材料构成。在另一实施例中，所述管由金属或石英构成。可直接或间接加热所述管。在一些实施例中，其可直接或间接加热到50-600°C的温度。在另一实施例中，所述管可直接或间接加热到150-450°C的温度。在另一实施例中，由材料/基质分析物的激光烧蚀点和通向质谱仪的真空的离子入口界定的离子源区域中的电场小于800V。在另一实施例中，所述离子源区域中的电场小于100V。在另一实施例中，离子源区域中的电场是0V。在另一实施例中，离子源区域中的电场小于OV。材料可以是生物材料或非生物材料。在某些实施例中，材料是生物材料并且可以是(但不限于)蛋白质、肽、碳水化合物或脂质。在其它实施例中，材料是非生物材料并且可以是(但不限于)聚合物或油。本文所揭示的实施例可包括使用无溶剂或基于溶剂的材料/基质分析物制备方法分析材料/基质分析物。在一实施例中，所述分析包括表面成像和/或电荷远程断裂以用于结构表征。在另一实施例中，质谱仪用于分析材料/基质中的分析物。所述分析可在正离子或负离子模式下进行。激光烧蚀可在透射或反射几何条件下完成。透射几何条件使烧蚀区域最小(例如组织中的亚细胞)。所述表面可以是(但不限于)在反射模式下的玻璃、石英、陶瓷、金属、聚合物，或在透射模式下的玻璃、石英和/或聚合物。


图I展示用于获得图2-14(七种肽、两种小蛋白质和四种脂质)中所示的图像的基质(2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)/分析物)的照片。图2描绘P -淀粉样蛋白(33-42)的无溶剂和基于溶剂的分析。 图3描绘促脂解素的无溶剂和基于溶剂的分析。图4描绘加压素的无溶剂和基于溶剂的分析。图5描绘强啡肽(dynorphin)的无溶剂和基于溶剂的分析。图6描绘P -淀粉样蛋白(1-11)的无溶剂和基于溶剂的分析。图7描绘物质P的无溶剂和基于溶剂的分析。图8描绘蜂毒肽(mellitin)的无溶剂和基于溶剂的分析。图9描绘P -淀粉样蛋白(1-42)的无溶剂和基于溶剂的分析。图10描绘牛胰岛素的无溶剂和基于溶剂的分析。图11描绘2-花生四烯酰基甘油(2-AG)的无溶剂和基于溶剂的分析。图12描绘N-花生四烯酰基Y氨基丁酸(NAGABA)的无溶剂和基于溶剂的分析。图13描绘磷脂酰肌醇(PI)的无溶剂和基于溶剂的分析。图14描绘磷脂酰胆碱(PC)的无溶剂和基于溶剂的分析。图15描绘根据形状的同重分子(具有相同标称质量的化合物)的无溶剂分离。图16展示对根据形状的异构分子(元素组成相同但结构不同的化合物)说明的无溶剂分离。图17提供使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)使质谱法成像的方法的示意图，其展示用于真空或大气压(AP)方法(AP-MALDI和激光喷雾电离(LSI))的更均质无溶剂基质/分析物制备的优点。图18描绘TissueBox的示意图，其展示在组织切片上制备基质。图19描绘TissueBox的照片。图20描绘显示内部的TissueBox的适配器组固持器。图21描绘球磨装置(TissueLyzer (加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen，Valencia, CA)))，其以所需时间和频率同时震荡两个适配器组以使得球状物通过球磨方法
研磨基质。图22A-B描绘用44微米筛网球磨(DHB基质，在25Hz下30秒)后的基质晶体尺寸。图22A展示放大100倍(500 u m比例尺)和放大100倍的插图(50 u m比例尺)。图22B展不使用扫描电子显微术(Scanning electron microscopy, SEM)放大3000倍的10 u m比例尺。图23描绘用44微米筛网球磨(DHB基质，在25Hz下30秒)后的基质晶体尺寸。图24描绘约10 ii m尺寸的图25的基质晶体的放大图。图25描绘使用安装有不同筛网尺寸和不同不锈钢珠粒(I. 2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz频率和60秒持续时间、使用20 U m筛网转移基质的TissueLyzer设定沉积于空显微载片上的基质的光学显微术图像。使用DHB基质。图26描绘如图25中但使用a -氰基-4-羟基-肉桂酸(CHCA)基质获得的基质 的光学显微术图像。图27描绘使用安装有不同筛网尺寸和不同不锈钢珠粒(I. 2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz频率和5分钟持续时间、使用3 ii m筛网转移基质的TissueLyzer设定沉积于空显微载片上的基质的光学显微术图像。使用CHCA基质。图28展示使用(I)快速无溶剂SurfaceBox基质沉积(左)和(2)喷涂(右)和CHCA基质时小鼠脑组织的组织成像(A)用CHCA基质覆盖的组织的照片；(B)质谱；(C)各别m/z值的MS图像对于无溶剂为(I) 779. 6和(II) 843. 3以及对于基于溶剂为(1)726.3和(11)804. 3。图29描绘小鼠脑的无溶剂DHB制备。图30描绘在布鲁克(Bruker)仪器(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克 达托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc. , Billerica, MA))上使用2, 5-DHB作为基质时小鼠脑的无溶剂 TissueBox 制备。图31描绘用乙醇洗涤且用溶于50 50 0. 2乙腈(ACN) /水/三氟乙酸(TFA)中的芥子酸基质点样的小鼠脑的MALDI-飞行时间(Time of Flight，TOF)MS质谱。图32A-B描绘用乙醇洗涤且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质点样的小鼠脑的LSI-MS质谱。图33描绘激光烧蚀后用乙醇洗涤且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质点样的小鼠脑。图34描绘使用双筛网方法产生较细粒径的图。图35描绘双筛网TissueBox方法的图。图36展示使用如下TissueLyzer条件时使用(I)铬珠粒和(2)不锈珠粒预研磨的基质的SEM图像(A) 15Hz频率持续30分钟和(B) 25Hz频率持续5分钟。图37展示使用安装有3iim筛网尺寸和不同不锈钢珠粒(I.2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz频率和5分钟持续时间的TissueLyzer设定沉积于小鼠脑组织切片上的DHB基质的光学显微术图像。展示透射光。图38展示使用SurfaceBox沉积于小鼠脑组织切片上的DHB基质的光学显微术图像，并提供在25Hz/300秒下根据44X 3 y m筛网的DHB的光学显微术图像。图39展示使用安装有3iim筛网尺寸和不同不锈钢珠粒(I.2mm和4mm)的SurfaceBox且使用25Hz频率和5分钟持续时间的TissueLyzer设定沉积于小鼠脑组织切片上的DHB基质的光学显微术图像。展示反射光。图40展示与单筛网TissueBox (图23)相比提供小于< 5 ii m的粒子的显著增加的双筛网TissueBox (比例尺在右下角)。
图41描绘比较常规RG (上部)与TG (下部)的流程。图42描绘用于在AP下产生离子的基质涂覆和基于激光的源设计的示意图。图42⑷展示RG且图42⑶展示TG。图43展示使用无场透射几何条件大气压(LSI)分析小鼠脑组织的结果。图44描绘小鼠脑切片的分析。图45描绘激光烧蚀后图44(1)的经无溶剂基质处理的组织切片。图46描绘激光烧蚀后图44 (I)的经无溶剂基质处理的组织切片；包围凹坑的其余基质指示基质有助于组织的烧蚀过程。图47描绘激光烧蚀后图44(2)的经无溶剂基质处理的组织切片。 图48是两种不同无溶剂样品制备方法的图。图49描绘使用LSI形成多电荷离子的实验的结果。图50从正面描绘离子最大源的特写图，以最显著位置展示固持于x、y、z台上的聚焦透镜。图51描绘极接近于离子入口孔(小孔)的石英板的特写图。图52描绘通过仅以正向和反向移动使石英板多次穿过激光束而形成穿过基质的线(心形)。图53描绘溶于2，5_DHB基质中的鞘磷脂。图54展示来自鞘磷脂的全部为单电荷的离子。图55描绘溶于2，5_DHB中的磷脂酰甘油，展示单电荷离子。图56描绘溶于2，5-DHB中的磷脂酰肌醇的谱图，展示单电荷离子。图57描绘溶于2，5_DHB中的大麻素(anandamide)的谱图，展示单电荷离子。图58描绘溶于2，5_DHB中的NAGly的谱图，展示单电荷离子。图59描绘亮氨酸脑啡肽(Leu-Enkaphelin)的谱图，通过LSI展示单电荷离子。图60描绘缓激肽的谱图，通过LSI展示双电荷离子和无单电荷离子。图61描绘物质P的双电荷离子的谱图。图62描绘血管紧张素I的LSI谱图。图63描绘血管紧张素I的ESI谱图。图64描绘ACTH的谱图，展示在递增的分子量下LSI产生较高电荷状态。图65描绘具有电荷状态+4的淀粉样蛋白1-42的谱图。图66描绘具有电荷状态+5的淀粉样蛋白1-42的谱图。图67描绘具有电荷状态+6的淀粉样蛋白1-42的谱图。图68描绘牛胰岛素的谱图，展示电荷状态+4和+5。图69描绘放在载玻片上的基质/分析物样品制备物上的金属丝网。图70描绘使用图69的金属丝网的结果。图71A-C描绘胰蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)蛋白质消化物的LSI-离子迁移率光谱法-质谱法(MS) -MS和MS/MS，其使用基于溶剂的样品制备条件和2，5-DHAP基质，150°C的锥孔温度和所安装的脱溶剂化装置(未加热)I) IMS-MS (图71 (A) )、II) Triffave切片的图71 (B)阱和图71 (C)转移区域中的CID断裂。左边显示质谱且右边显示漂移时间分离相对于质荷比(m/z)的2D图。
图72描绘总无溶剂分析的益处的实例。 图73A-B描绘通过粗油样品的无溶剂样品制备、随后LSI-MS-MS采集得到的TSA。图74A-C描绘TSA质谱。图75描绘使用2，5-DHB和使用400°C的经加热转移毛细管在LTQ Velos仪器上进行碳酸酐酶(平均分子量29029)蛋白质的LSI。图76描绘在LTQ-ETD Velos仪器上进行LSI。 图77描绘OVA肽323-339的不同电荷状态的LSI-CID质谱。图78A-F描绘如下比较图78 (A，D)混合物I的LSI-LTQ-MS分析，和图78 (B，E)GF (m/z = 612.4)的CID谱图。图78(C，F)展示血管紧张素I (m/z = 648. 9)，使用DHAP和DHB基质。图79A-B 描绘使用 OVA 肽 323-339 (m/z 444. 554)的 CID 得到的 LSI-MSn 谱图。图80A-B描绘血管紧张素-I的MS/MS谱图。图81A-B描绘氧化的P -淀粉样蛋白10-20的MS/MS谱图，m/z 488 (A)LSI_CID、(B) LSI-ETD，使用 DHB。图82A-E描绘的照片说明LSI-MS分析的优化和益处(I)利用精确和连续烧蚀，使用SYNAPT G2的XYZ台(左栏)，即手动成像实验装置进行采集，(A)到(C);封埋有基质/分析物样品的载玻片=(D)基于溶剂到(E)无溶剂样品制备，使用2，5-DHAP和血管紧张素
Io图83A-B描绘基于溶剂沉积且在透射几何条件LSI型设定下通过N2激光烧蚀的2,5-DHB的显微术。图84描绘在MS-MS SYNAPT G2上进行源修改以使得能够脱除在激光烧蚀期间所形成的基质/分析物簇的溶剂，从而获得类似ESI的多电荷离子。图85描绘脱溶剂化装置金属材料的比较研究。利用使用I)血管紧张素1、2)牛胰岛素和3)泛素作为样品的A)铜和B)不锈钢获得LSI-MS质谱，使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质制备。图86描绘使用铜脱溶剂化装置且使用2，5-DHAP作为基质时以下物质的LSI-MS质谱1)血管紧张素1、2)胰岛素、3)泛素和4)溶菌酶，A)不使用热，和B)施加额外的热(5V)。图87描绘泛素的多电荷结构的LSI-MS-MS。图88描绘LSI-MS-MS。部分(I)展示质谱且部分(2)展示以下各物的td相对于m/z的2D图A)细胞色素C、⑶溶菌酶和C)肌红蛋白，其是使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质制备并且使用铜脱溶剂化装置在不使用热的情况下获得。图89描绘￠-淀粉样蛋白(1-42)与(42-1)的异构蛋白质的LSI-MS-MS，其使用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP基质且使用铜脱溶剂化装置在不使用热的情况下获得。图90描绘使用2JDHAP基质时阿兹海默氏病的非淀粉样蛋白组分(NAC)的LSI-IMS-MS TSA,其是使用铜脱溶剂化装置在不施加热的情况下获得。图91A-B描绘来自LTQ-Velos的血管紧张素I的LSI质谱。(A)使用饱和DHAP溶液(50 50 ACN/水)且(B)溶液升温并变得超饱和，从而在各2 ii L斑点中存在更多基质。图92描绘来自ABA溶液(50 50 ACN/水)的单电荷和双电荷血管紧张素I负尚子的LSI LTQ质谱。图93描绘双电荷血管紧张素I正离子和负离子的LSI-MS-MS漂移时间分布。图94A-C描绘通过DHAP使用TSA产生多个电荷。图95展示的图指示由无溶剂制备的各基质产生的最高血管紧张素I电荷状态(+2到+3)的比率与超过五分钟的研磨时间成反比。图96描绘用DHAP基质烧蚀的血管紧张素I的LSI-MS谱图。图97描绘通过337nm激光烧蚀的DHB。图98描绘通过较高通量的355nm激光烧蚀的DHB。图99描绘通过337nm激光烧蚀的ABA。 图100描绘通过355nm激光烧蚀的ABA。图101A-C描绘通过电荷远程断裂进行脂肪酸分析。图102描绘通过电荷远程断裂进行脂肪酸分析。图103描绘用于血管紧张素I的传统电离方法的总结。图104描绘图103中所示的用于血管紧张素I的传统电离方法结合LSI的总结。图105描绘LSI-MS示意图和结果。图106展示LSI仪器的照片。图107A-B描绘使用2，5-DHB作为基质时牛胰岛素的LSI-MS-MS。图108描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为对加热线施加约5伏特)时溶菌酶与泛素的较低丰度蛋白质混合物的LSI-IMS-MS。图109描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为对镍铬合金加热线施加约5伏特)时，在与图108类似的浓度下泛素的二维漂移时间相对于m/z。图110描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时，在与图108类似的浓度下溶菌酶的二维漂移时间相对于m/z。图111描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时，在与图108相同的浓度下泛素和溶菌酶的二维漂移时间相对于m/z。图112A-B描绘泛素和溶菌酶的MS。图113描绘使用2，5-DHB在不施加热的情况下粗油的LSI-MS-MS分析图114描绘使用2，5-DHB在施加热的情况下粗油的LSI-MS-MS分析。图115A-D描绘使用2，5-DHAP和脱溶剂化装置在不施加热的情况下分子量递增的蛋白质的LSI-MS-MS。图116描绘用于分析异构蛋白质的LSI-MS-MS，所述蛋白质由于m/z相同且如这里所示电荷状态分布极其相似而未能通过质谱法来区分。图117描绘P淀粉样蛋白(1-42)的二维漂移时间相对于m/z。图118描绘P -淀粉样蛋白(42-1)的二维漂移时间相对于m/z。图119描绘用于使用泛素的ESI-MS-MS与LSI-MS-MS比较的条件。图120描绘以2维漂移时间相对于m/z图显示的泛素的LSI-MS-MS结果。图121描绘以2维漂移时间相对于m/z图显示的泛素的ESI-MS-MS结果。图122描绘针对图120和121的所有电荷状态所选取的漂移时间分布。图123描绘用于图124-127中所示的结果的条件。
图124描绘在递增锥孔电压下获得的MS，显示离子丰度增加和较低电荷状态(电荷剥离)。选取针对电荷状态+9、+7、+5的漂移时间分布。图125描绘从图124选取的针对电荷状态+9的漂移时间。图126描绘从图124选取的针对电荷状态+7的漂移时间。图127描绘从图124选取的针对电荷状态+5的漂移时间。图128描绘与蛋白质(左图)相比蛋白质复合物(右图)的LSI-MS-MS漂移时间分布。图129描绘牛胰岛素的TSA。图130描绘血管紧张素I的TSA。 图131描绘对以I : I摩尔比存在的脂质(鞘磷脂，SM)与肽(血管紧张素l，Ang.I)的基于溶剂的分析。图132描绘对以I : I摩尔比存在的脂质(鞘磷脂，SM)与肽(血管紧张素l，Ang.I)的TSA分析。图133描绘使用Orbitrap Exactive得到的平坦载玻片上用溶于50 : 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质点样的脱脂新鲜组织的LSI-MS完整和插图质谱总和，展示多电荷蛋白质离子。图134A-B2描绘使用LTQ-Velos得到的平坦载玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质点样的脱脂新鲜组织的LSI-MS谱图。图135描绘LSI MS，展示使用Orbitrap Exactive从平坦载玻片上用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP点样的脱脂老化组织检测到的最高质量离子的同位素分布。图136A-B3描绘使用Orbitrap Exactive得到的平坦载玻片上涂有金的载玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP点样的脱脂新鲜组织的LSI MS。图137描绘LSI MS的插图。图138A-B描绘平坦载玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质(放大100倍)(图138A)和2，5-DHB (放大5倍)(图138B)点样的脱脂新鲜组织在使用LSI-IMS激光烧蚀后的显微术。图139A-B描绘涂有金的载玻片上用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质(放大100倍)(图139A)和2，5-DHB (放大10倍)(图139B)点样的脱脂新鲜组织在使用LSI-IMS激光烧蚀后的显微术。图140A-B描绘涂有金的载玻片上用溶于含0. 1% TFA的50 50 ACN 水中的芥子酸(图140A)和溶于50 50 ACN 水中的2，5_DHAP(图140B)点样的脱脂新鲜组织的MALDIMSo图141A-B描绘平坦载玻片上用溶于含0. 1% TFA的50 50 ACN :水中的芥子酸(图141A)和溶于50 50 ACN 水中的2，5_DHAP(图141B)点样的脱脂新鲜组织的MALDIMSo
具体实施例方式基质辅助激光解吸/电离(MALDI)是一种用于质谱法(MS)中的电离技术，其允许分析许多(生物)分子。也已充分建立通过MS进行成像，尤其使用次级离子质谱法(SMS)。然而，SMS仅勉强适用于完整生物组织或其它表面。(AP)-MALDI成像因为其在高空间分辨率下的敏感度问题而同样受限。常规AP-MALDI通过激光烧蚀基质/分析物主要产生单电荷或低电荷状态离子。在AP-MALDI中，对样品固持板施加电压以帮助使低电荷状态离子上升并集中到质谱仪的离子入口小孔中。商业AP-MALDI源在对样品板施加的约2000V下达到最大离子丰度并在低于约500V时产生极少离子。通常，样品载体安置于电离室内以使得所沉积的样品接近电离室与光谱仪之间界面的进入孔，从而使得样品可在反射几何条件下由激光束照明。这种样品载体通常选自包含传导性材料的群组。如果样品载体具有传导性，那么其通常用作电极以提供将电离分析物从靶表面移动到界面上的进入孔的电场，电离分析物通过所述进入孔进入光谱仪。在MS期间使用溶剂的传统分析方法也产生许多缺点。举例来说，包括蛋白质在内的许多(生物)分子通常不溶于常见溶剂中。另外，错误折叠的蛋白质具有暴露的疏水性区域并且可形成不溶性聚集体。许多重组蛋白质当在异源宿主中过表达时，会因为错误折叠而变得不溶或发展诸如阿兹海默氏病等疾病状况。 另外，在基于溶剂的MS样品制备中，会出现人为因素，诸如色氨酸和甲硫氨酸残基的氧化(科恩(Cohen)，分析化学(Anal. Chem.) 2006 ；78 =4352-4362 ；弗洛里希(Froelich)等人,蛋白质组学(Proteomics) 2008 ；8 :1334-1345) 这些人为因素可在组合样品和基质的溶液的同一时段内产生。因此，基于溶剂的MS可能对于与了解氧化应激有关的应用并非最佳。本发明提供通过质谱法(MS)改进材料分析和表面成像(包括组织成像)的系统和方法。所述系统和方法利用激光喷雾电离(LSI)方法，其产生更易通过MS仪器检测的许多多电荷离子，而非通过常规基质辅助激光解吸/电离(MALDI)产生的主要为单电荷的离子。激光可以在反射或透射几何条件下关于样品固持器对准，但当在透射几何条件下对准时改进空间分辨率，这对于表面成像分析尤其重要。跟踪LSI的MS可以是基于溶剂或无溶剂分析。跟踪LSI的无溶剂分析避免了上文所述的与基于溶剂的分析相关的许多缺点。无溶剂分析还允许改进的空间分辨率，其有利于MS表面成像。本发明的多电荷离子允许扩大高效质谱仪的质量范围，其通常限于质荷(m/z)比4000。对于单电荷离子，这使得分子量限于4000道尔顿。带多个电荷还可以改进断裂，如使用电子转移解离(ETD)所证明。本文提供产生多电荷离子的方法，其类似于电喷雾电离(ESI)，在大气压或接近大气压下，但对基质/分析物使用激光烧蚀而非如ESI中的施加电压和液体溶液。许多类似ESI的方法，诸如解吸ESI (DESI)和AP-MALDI方法，可产生多电荷离子，但始终存在电场(通常以千伏特计)和使用液体溶剂。本文所揭示的方法允许通过LSI快速分析(每个样品约I秒)和精确质量测量(< 5ppm)。这些方法进一步允许通过LSI进行质量特定表面成像(包括组织成像)和任选的无溶剂分析。这些方法还允许LSI与液态分离联用，和通过TSA进行相对定量。诸如(但不限于)寡核苷酸、聚糖和糖蛋白等其它化合物类别可以通过LSI来进行分析。通过LSI产生多电荷离子不需要电场并且用于AP-MALDI的高电场可能对多电荷离子的产生是有害的。在一些实施例中，经激光烧蚀的材料可穿过加热区域，随后进入用于质量分析的质谱仪的高度真空。LSI的优点是使用激光，因此具有高空间分辨率，基于溶剂或无溶剂样品制备(对于溶解度有限的化合物和对于用于组织成像的改进的空间分辨率为无溶剂)，多电荷离子扩大高效质谱仪的质量范围并且改进断裂以用于结构分析。LSI还允许在多电荷离子与单电荷离子之间快速转换。转换无溶剂条件也会随意产生单电荷或多电荷离子。期望当在大气压下和在真空中操作时，可提高空间分辨率，从而在透射模式下从背面对准激光。基质可以是在激光波长下吸收的许多小分子中的任一种，诸如(但不限于)在33711111下为2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)、2，5_ 二羟基苯乙酮(2，5_DHAP)和2-氨基苯甲醇(2-ABA)和在355nm下为2，5_DHAP ;和/或具有类似位置官能团的其它小芳香族分子。材料/基质可用于产生多电荷离子，其具有低蒸气压或在室温下是液体，诸如2-氨基苯甲酸乙酯(N2激光，337nm)或2-羟基苯乙酮(Nd/YAG激光，355nm)。用溶剂润湿或甚至在溶剂中蒸发的基质材料通常在LSI条件下产生多电荷离子。
用于这些实验的激光可以是在紫外区中具有输出功率的任何激光，但最通常是氮气激光(337nm)或三倍频Nd/YAG激光(355nm)。在一些实施例中，加热区域可以是加热管，经激光烧蚀的材料必须瞬间穿过所述加热管到达真空。所述管可以是金属、石英或任何耐热材料，其不会放出对质谱仪真空系统有害的蒸气。在一些实施例中，所述管可直接或间接加热到50-600°C，或在一实施例中加热到 125-450 0C o由基质/分析物的激光烧蚀点和通向质谱仪的真空的离子入口界定的离子源区域中的电场可小于500V。在一些实施例中，所述电场可小于100V，或是0V，或甚至-100V。激光束可在反射几何条件下撞击基质分析物表面，其中激光从与烧蚀同一面(朝向MS离子入口小孔烧蚀)撞击样品，或通过使激光束透射几何条件模式穿过激光波长可透过样品固持器以在膨胀的基质分析物股流朝向离子入口小孔之情况下从相对于激光烧蚀的基质/分析物的另一面撞击样品来撞击样品。在反射模式下，诸如(但不限于)金属、玻璃或塑料等金属或非传导性表面可用作样品固持器，且在透射几何条件下，诸如(但不限于)玻璃、石英和塑料等激光束传导性材料可用作样品固持器。如果离子源电压较低且应用加热转移区域，那么激光烧蚀添加有基质的组织可产生例如蛋白质的多电荷离子。这尤其具有价值，因为其允许使用高效质谱仪进行组织成像并在AP条件下使用。使用这种方法，在100，000的质量分辨率(相对于1000-2000的先前分辨率大大增加)和5ppm的质量精确度(与25-100ppm的先前质量精确度相比)下获得来自组织的蛋白质的谱图，从而使得蛋白质鉴别改进了很多。如本文所述进行的无溶剂基质辅助激光解吸/电离(MALDI)分析显示可获得均质覆盖。因此，所得均质样品可由于晶体尺寸无可变性而使用较小激光功率从几乎每个激光点产生离子，由此有效地降低化学非均质性(“热析点”或“热点”，从而改进质量测量的定性和定量方面)、非所需分析物断裂和化学背景(基质信号)。另外，在基于溶剂的方法中，在蛋白质下游处理期间样品的损失可高达50%。在无溶剂MALDI方法中，这种局限性可有所降低，在一些情况下显著降低，因为在使用珠粒以机械方式混合分析物与材料/基质的步骤期间可有效地从小瓶的壁上回收样品。图56和57提供指示传统MALDI与无溶剂MALDI之间的一般差异的示意图。本文所揭示的方法也可用于自动无溶剂基质沉积方法，其允许在约I分钟内使用20 u m筛网制备具有晶体尺寸范围为< I到12 y m的均质基质覆盖的纯的组织样品。可通过在约5分钟内使用3 筛网球磨各别基质而使所述尺寸进一步减小到尺寸为< I到5 U m的晶体。将这种快速表面涂覆方法应用于小鼠脑组织且将结果与使用MALDI-飞行时间(TOF)质谱仪的基于溶剂的喷涂方法(实例4)进行比较。可显示在MALDI-离子迁移率光谱法-质谱法(IMS)-TOF质谱仪上进行的总无溶剂分析(TSA)使用无溶剂气相分离来分离同重组合物。本发明的无溶剂MALDI方法的实例为分析淀粉样蛋白肽(实例8)。淀粉样蛋白肽(1-42)是阿兹海默氏病发病机制的关键，其引起氧化应激并且转化为不溶性神经毒性
淀粉样蛋白原纤维形式。除关于与阿兹海默氏病有关的乙酰化和磷酸化的蛋白质修饰变化外，有证据表明主要涉及His-6、His-13、His-14和Met_35。Met_35的氧化还作为错误 折叠淀粉样前驱蛋白(APP)和阿兹海默氏病的发作原因来进行讨论。然而，根据本发明，淀粉样蛋白肽的疏水性组分显示无溶剂MALDI分析可在不使用MS不相容清洁剂的情况下克服这些氧化人为因素，以及溶解度问题。疏水性肽的电离抑制以及发射间(shot-to-shot)非再现性也可极大地降低，从而改进分析的定量方面。经胰蛋白酶消化的淀粉样蛋白肽(1-42)可使用无溶剂方法得到100%序列覆盖，然而基于溶剂的MALDI由于溶解度和电离问题而不能检测疏水性肽。对于细菌视紫红质(一种膜蛋白)的分析可见类似改进。根据本发明，利用各别样品固持器(例如微量滴定板)同时进行制备、均质化和直接沉积于MALDI板上的无溶剂MALDI方法可提高高通量分析的可能性。用于蛋白质/肽分析的无溶剂MALDI方法的当前局限性包括相对于基于溶剂的方法的较高材料需要量和会增加分析时间的金属加合的较大趋势。这可通过连接至少一种金属阳离子(Na+)来克服，这使得使用无溶剂MALDI分析来分析疏水性肽较为可靠。基质/分析物的无溶剂或基于溶剂的制备可产生多电荷离子。无溶剂样品制备可具有关于组织样品的优点，因为其可消除由溶剂使化合物扩散。其也可适用于不要求溶剂溶解度的情况。本发明的另一实施例是SurfaceBox/TissueBox,其可提供将基质涂覆于组织以提供高分辨率成像的无溶剂方法。其也可与微量滴定板一起使用以同时制备多样品无溶剂样品并且直接转移到MALDI靶板，所述板可为(但不限于)显微镜载玻片。载玻片消除与昂贵金属样品板相关的携带和清洁问题。透射几何条件可允许较高空间分辨率表面成像。组织盒、透射几何条件和激光喷雾多电荷离子的组合可适用于使较大分子成像。与真空电离相比，大气压可使得方法更快和生理学上更适当。使用如本文所述的这些方法，空间分辨率与质量分辨率都可能较闻。因此，本文所述的系统和方法提供任选地使用无溶剂基质沉积和/或分离的LSI的快速和简单方法。所述系统和方法说明MALDI中的多个电荷可提供更有效的断裂并且扩大适用质量范围。所揭示方法的优点包括使超过4，OOODa分子量的蛋白质成像的能力，诸如图65中所示的P淀粉样蛋白(1-42)。本发明还展示高压对使分子成像的能力的作用，如图70中所示。本文所述的系统和方法允许类似于ESI而产生多电荷离子。LSI可使用传统用于真空或AP-MALDI中的基于溶剂的样品制备方法或使用无溶剂样品制备来进行。基质/分析物LSI样品可在透射几何条件下或在反射几何条件下用激光(N2激光337nm ；Nd/YAG激光355nm)烧蚀以产生LSI离子。在低电压或无电压下在样品板与离子入口孔之间获得离子。这允许使用(但不限于)玻璃、塑料或金属样品固持器。透明玻璃和塑料(有或无金属涂层)允许透射几何条件。低电压可包括低于500或1000伏的水平。本文所揭示的方法的多电荷离子是通过如下机制来产生，其中将分析物捕捉于通过基质吸收激光能量所产生的多电荷基质液滴中。形成气体喷射，从而将多电荷液滴向离子入口孔推进。这一过程的动量允许在无电场的情况下带电荷液滴达到离子入口孔。脱除这些多电荷液滴的溶剂以产生多电荷离子。因此，在离表面经测量以毫米而非微米计的一定距离处产生多电荷离子。使用某些基质，脱溶剂化能力可小于其它基质，但所有基质都将优选地使用加热产生基质蒸发(脱溶剂化)，从而产生多电荷分析物离子。因此，脱溶剂化区域用于产生激光喷雾离子，但一般不用于产生MALDI离子。使用加热管(由不同金属构成，诸如(但不限于)铜或不锈钢；不同直径和长度；并且除圆锥体加热外应用和不应用加热)，在所述加热管中将离子从大气压转移到作为脱溶剂化区域的真空。这具有如下优点离子可在层流中产生，从而减少壁上的损失并允许集中在较低压力下离开毛细管的离子，使用所述构件作为在较低压力区域中操作的离子漏斗。在电场不存在下形成多电荷液滴(或簇)的另一优点是使离子入口孔处从AP到真空区域的损失(“边缘损失”)减到最少。 本文所揭示的系统和方法的实例可用于分析(但不限于)蛋白质、脂质、表面和组织和/或使其成像。然而，所述系统和方法并不限于用于蛋白质、肽和脂质，也可直接用于诸如组织等复杂表面。聚合物和塑料是适合于如本文所揭示的分析的非限制性示范性材料。也可以分析寡核苷酸。本文所揭示的系统和方法也适合于蛋白质组学和代谢组学领域中的分析。激光可以是红外(IR)或紫外(UV)激光。激光喷雾电离(LSI)可与无场透射几何条件AP-MALDI互换使用。方法描述中对参考文献的引用中有关参考方法的教示内容以引用的方式并入本文中。I.实例 I这一实例描述使用激光喷雾电离在AP下和在高空间分辨率和超高质量分辨率下直接从组织分析蛋白质。这一实例中所述的实验的结果表明LSI-MS可组合分析速度、高空间分辨率、和使用ESI的软电离、带多个电荷、断裂和横截面分析的MALDI的成像能力。A.引言通过MS进行组织成像证实适用于诸如检测肿瘤边缘、确定高药物摄取部位和在脑组织中定位信号传导分子等领域。已充分建立使用次级离子质谱法(SIMS)进行成像，但其仅勉强适用于生物组织和其它表面的完整分子质量测量。在真空条件下操作的MALDI MS已成功地用于组织成像，尤其用于高丰度组分，诸如膜脂、药物代谢物和蛋白质。已实现约20 ii m的空间分辨率且MALDI-MS方法已试图用于阐明帕金森氏症(Parkinson' s)、肌肉萎缩症、肥胖和癌症疾病。用纯溶剂、用水稀释的溶剂或与有机溶剂混合的溶剂进行组织固定或洗涤可提高肽和蛋白质的信号质量，以及延长组织寿命，随后进行基质应用。施瓦兹(Schwartz)等人开发了一组关于以下的实践指南组织切片(组织储藏、切片和封片)的适当处理，肽和蛋白质分析，和基质的选择和浓度，溶剂组成，基质沉积策略，和使用MALDI采集最佳质谱数据的仪器参数。(施瓦兹(Schwartz)等人,质谱学杂志(J. Mass Spectrom) 2003 ；38 699-708)。组织厚度也会影响总体峰值强度和对于肽和蛋白质所观察到的峰的总数。另外，基质的选择和其沉积于组织上对于确定从组织提取和检测的蛋白质的亚群很重要。令人遗憾的是，使用基于真空的MS进行与分析纯的组织有关的组织成像存在缺点。这些研究中所用的质谱仪通常还具有不足质量分辨率和质量精确度。因为真空电离方法产生单电荷离子，所以质量选择性断裂方法仅提供有限信息，尤其关于肽和蛋白质的信 息。另外，无高级断裂，诸如电子转移解离(ETD)可用于确信的蛋白质鉴别。AP-MALDI组织成像可与高分辨率质谱仪联合，但在高空间分辨率下存在敏感度问题。AP-MALDI也主要产生单电荷离子。因此，在这些质谱仪上由于其固有质量范围局限性(通常质荷比(m/z) < 4000)而不可能使用AP-MALDI进行完整蛋白质的质量和横截面分析。LSI，一种在AP下操作的类似MALDI的新方法，相对于其它用于蛋白质组织成像的基于MS的方法具有如下优点，包括分析速度、改进的空间分辨率、更适当AP条件、通过带多个电荷扩大质量范围和改进断裂、和在适当仪器上获得横截面数据的能力。已证明在高效AP电离质谱仪(Orbitrap Exactive, SYNAPT G2)上LSI对于高质量化合物之适用性,从而产生类似ESI的多质子化离子。通过ETD使用LSI方法展示序列分析的第一实验已成功地在赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)LTQ-ETD质谱仪上进行。对于泛素(一种重要的调节蛋白)获得几乎完整序列覆盖。将ETD断裂应用于LSI-MS分析可提供一种研究生物过程的新方法，包括从完整蛋白质和直接从组织定位磷酸化、糖基化和泛素化位点。此外，不同于ESI和相关基于ESI的方法(诸如解吸-ESI)，LSI方法允许高空间分辨率成像，如对于脂质所示(约10到约SOil m)。与AP-MALDI相同开发阶段的报导相比，LSI的灵敏度大一个数量级以上并且能够在高分辨率质谱仪上分析蛋白质，如通过在将仅17飞摩尔(femtomole)牛胰脏胰岛素涂覆于显微镜载玻片上后获得完整采集质谱所证明。LSI方法的速度已通过在8秒内获得五个样品的质谱来展示，并且预计所述方法可在不到I秒内在机械移动下分析样品。在MS中未呈现的是，使用Orbitrap质谱仪装置，在100，000质量分辨率和聚焦烧蚀约300 y m3空间体积的氮气激光下证明直接从小鼠脑组织进行完整蛋白质分析的效用。B.实验程序I.材料基质，2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHB)98%、2，5-二羟基苯乙酮(2，5-DHAP)99. 5 %和芥子酸(SA) 99%购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich, Inc.,St. Louis, MO)。溶剂，ACN、三氟乙酸(TFA)和EtOH购自宾夕法尼亚州匹兹堡的飞世尔科技公司(Fisher Scientific Inc. , Pittsburgh, PA)。使用纯水(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore' s Corporate, Billerica, MA))。平坦的显微载玻片(尺寸为76.2X25.4X1_)是获自新罕布什尔州朴次茅斯的金密封产品公司(Gold SealProducts, Portsmouth, NH)。用于成像实验的涂有ITO的传导性载玻片是布鲁克公司(Bruker)(马萨诸塞州比尔里卡(Billerica, MA))的赠品。2.小鼠脑组织用C02气体对20周龄的C57B1/6小鼠施以安乐死并且用冰冷的I X磷酸盐缓冲生理盐水(150mM NaClUOOmM NaH2P04，pH 7.4)经贲门灌注5分钟以去除红细胞。将脑冷冻在_22°C下且使用莱卡(Leica) CM1850冷冻切片机(伊利诺斯州班诺克本的莱卡微系统公司(Leica Microsystems Inc. , Bannockburn, IL))依次切割成 10 U m 切片。将组织切片放在预冷却的显微载玻片(平坦的或涂有金)上，简单地用手指从背面加温以使得切片松弛并附着。小心避免因在含有干燥剂的气密盒中储藏(在_20°C下)和运输(在干冰下)封埋有组织的载玻片直到使用而引起的水冷凝。
3.老化和新鲜组织样品的分析这一研究中所用的小鼠脑组织切片在干冰中运输，随后脱脂(delipified)，接着在干冰中彻夜运输。在_5°C下储藏老化脱脂组织样品约两个月。起初对老化组织样品进行脱脂并通过MALDI-T0F-MS分析检验。使用最佳脱脂条件进行进一步研究，比较从MALDI和LSI-MS分析获得的结果。切下第二组小鼠脑组织，冷冻并立即彻夜运输。各平坦且涂有金的显微载玻片封埋有四到五片组织切片。一收到冷冻样品后，就如下文所述对载玻片上的组织进行脱脂并再次立即冷冻和彻夜运输以在Orbitrap Exactive (赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))质谱仪上进行即时LSI-MS分析。再次冷冻这些样品并彻夜运输以用于显微术和后续MALDI-MS和LSI-LTQ Velos分析。4.组织的脱脂根据公开程序去除组织切片中的脂质。简单来说，在干燥器中干燥封埋有组织的载玻片，随后用乙醇洗涤两次。在第一次洗涤时，将封埋有组织的载玻片浸没于填充有70%EtOH的玻璃皮氏培养皿(Petri dish)中，旋动30秒，并小心地移出。接着倾斜载玻片以去除溶剂并持续约10秒，立即在另一皮氏培养皿中用95% EtOH再洗涤30秒。第二次洗涤后，使载玻片在干燥器中干燥20分钟，随后进行分析，或储藏于约-20°C下直到使用为止或在干冰下运输。5.小鼠脑组织的激光喷雾电离(LSI)质谱法(MS)在Orbitrap Exactive或LTQ-Velos质谱仪上进行LSI涉及去除离子最大源和强制联锁或去除前窗和侧窗以允许激光和样品接近离子入口孔。简单来说，将激光束(337nm，新港公司(Newport Corporation)VSL-337ND-S)与质谱仪的离子入口孔对准。通过将许多0. 2uL液滴放在组织材料上来用溶解于50 50 ACN :水中的LSI基质(2，5-DHB或2，5-DHAP)制备封埋有小鼠脑组织的显微镜载玻片。溶剂蒸发后，将含有LSI基质涂覆于小鼠脑组织的载玻片接近地(I到3_)放在质谱仪离子迁移管入口(孔)前并且手动移动穿过关于离子入口孔180度对准(透射几何条件)的激光束。将AP到真空离子迁移毛细管加热到375°C (对于2，5-DHB)和300°C (对于2，5_DHAP)并且每次脉冲的激光通量为约0. 5-1J cm-2。在电场不存在下在离子源区域中观察到多电荷离子。所述布置允许手动粗组织研究以观察多电荷离子。使用平坦且涂有金的载玻片。6.小鼠脑组织的MALDI MS使用装备有氮气激光(337nm)的MALDI-T0F布鲁克(Bruker)UltrafIex质谱仪(德国不来梅的布鲁克公司(Bruker, Bremen, Germany))来监测组织脱脂的成效并与LSI结果进行比较。根据公开研究进行MALDI样品制备。洗涤组织并在干燥器中干燥后，用0. 2u L溶解于含0. 1% TFA的50 50 ACN 水中的SA基质或溶解于50 50 ACN 水中的2，5-DHAP点样组织。使用线性正离子模式，在20. 16kV的加速电压、18. 48kV的提取电压、7. 06kV的透镜电压和360ns的脉冲离子提取下获得质谱。优化延时提取参数以具有用于12kDa质量范围的最佳分辨率和敏感度。使用30次激光发射的增量，且将发射安置在单基质点内并在其中移动以获得具有总共120次激光发射的质谱。加工质谱并使用弗雷克斯(Flex)分析软件进行基线校正。使用平坦且涂有金的显微载片；预期仅涂有金的显微载片提供正确的质量校准。
7.显微术和空间体积测量进行光学显微术(尼康(Nikon)，ECLIPSE, LV 100)以通过在LSI-Orbitrap分析(并运输到WSU)后测量组织上的烧蚀区域来获得关于空间分辨率的定性信息。使用各种放大倍数条件，范围为5倍到100倍，从而提供降低到< Iym分辨率的详图。获得老化和新鲜组织样品的显微术数据。在10 厚的组织切片上以<3 宽度X < IOym长度空间分辨率提供< 300 y m3的界限分明的、高空间体积测定的典型实例，如对于老化组织切片所观察的。新鲜组织切片提供略微较好的分辨率。C.结果I.对老化组织样品评估实验条件在质谱组织分析之前这一研究中用于提取脂质的溶剂是基于先前报导的研究以及根据我们从MALDI-MS分析获得的结果来选择。使用两种溶剂对老化组织切片进行脱脂，但与使用SA作为基质的异丙醇洗涤相比，乙醇洗涤产生较高强度蛋白质MALDI-MS信号。在来自封埋于平坦的显微载玻片上的同一小鼠脑的不同组织切片上的大致同一位置进行质谱采集以用于两个脱脂程序。图31展示用乙醇洗涤且用溶于50 50 0.2 ACN/水/TFA中的芥子酸基质点样的小鼠脑的MALDI-TOF MS质谱。如图31中所示，所检测的肽和蛋白质信号的m/z在约5，000到19，000的范围内(图31)，其在西雷(Seeley)等人所提供的m/z范围内(西雷(Seeley)等人，美国质谱学会杂志(J. Am. Soc. Mass Spectrom) 2008 ；19 1069-1077);预期质量校准略微不精确，这是因为使用无传导性涂层的平坦的显微载玻片。仅几种所检测的蛋白质产生相当大的信号强度并且推测其来自组织中的最丰富蛋白质种类。在质量范围m/z设定为< 2200的Orbitrap Exactive仪器上使用LSI方法显示与主要电离蛋白质的2，5-DHAP相比，2，5-DHB对于电离脂质的极大偏好。类似于先前报导，使用LSI，使用2，5-DHB作为基质，仅观察到脂质信号，甚至在脱脂组织中也是如此，但在充分洗涤的组织中脂质信号以较低丰度存在。另一方面，如图32A中所示，用乙醇洗涤且用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质点样的小鼠脑的完整质谱主要显示多电荷离子。由于质谱分辨率提供13C同位素分离，因此单电荷状态分布是以高精确度测定蛋白质分子量唯一所必需的。因此，甚至恰好在杂波上方观察到的离子(无法可靠地鉴别其单同位素峰值)也提供与线性MALDI-TOF值类似的平均质量数据。图32B展示来自图32A的插图区域，其质量范围设定为m/z 650至1000。多电荷离子在+3到+8的范围内，表示离子的分子量为约650到5000Da。对于这个数据集，大多数离子是来自低于IOkDa的化合物，并且很可能是小蛋白质。图135展示在平坦的载玻片上从用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP点样的脱脂老化组织检测到的最高质量离子的同位素分布为约13kDa化合物(图135)。由于老化样品的储藏时间较长，有可能一些所观察到的蛋白质是来自死后的酶促消化。激光烧蚀后，获得显微术数据以检查LSI烧蚀组织区域的空间分辨率。使用类似源几何条件的先前组织分析研究使用作为基质的2，5-DHB的无溶剂应用产生平均约80 y m的空间分辨率，并且使用基于溶剂的基质沉积于未洗涤的组织切片上产生显著较大的烧蚀区域。如图33的光学显微术图像中所示，在改进的激光聚焦和使用2，5-DHAP作为基质的情况下，烧蚀区域的宽度在< 3到IOiim的范围内。烧蚀区域的长形特点(长度为约8到
15u m)可通过将所封埋的组织连续移动穿过所聚焦的激光束来解释。当在烧蚀区域附近沉积时见到基质表不LSI基质在组织材料的解吸/电尚中的功能。 2.对新鲜组织样品比较LSI-MS、显微术和MALDI-MS分析对于老化组织样品成功获得的结果促使检查除将组织封埋到载玻片所需的短时间外维持在_20°C或低于_20°C下的新鲜组织切片，脱脂，质谱分析和显微术。图133显示平坦的载玻片上使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质时新鲜脱脂样品的完整和插图MS总和，显示m/z 917. 50 (MW 1833.0)时存在丰富的双电荷LSI离子和较高m/z值时主要存在多电荷离子。观察到至少两种电荷状态分布的最高质量蛋白质的分子量为17，882Da，尽管对于分子量为约19，665Da的离子观察到单一低丰度同位素分布。在新鲜样品中也观察到在老化组织样品(图32B)中观察到的一些较低分子量蛋白质，但其丰度较低，而较高质量蛋白质明显更丰富。图136A-B3展示在单次激光发射中观察到最丰富蛋白质。图136A展示通过将组织移动穿过激光束并进入离子入口孔3_所获得的总离子流。在IHz下操作激光且每秒获得一次质谱采集。图136B1展示完整采集的总和，图136B2展示单次发射采集且图136B3展示表示约7次激光发射的7次连续质谱采集的总和。未观察到涂有金的载玻片(图136)与平坦的载玻片(图133)之间的显著差异。图137展示三种同位素分布，各对应于分子量为9908、11788和12369Da(单同位素质量)的蛋白质。图137中所示的蛋白质的同位素分布是使用设定为100，000质量分辨率的Orbitrap Exactive从涂有金的载玻片上用溶于50 50 ACN :水中的2，5-DHAP基质点样的脱脂新鲜组织得到。将来自同一只小鼠的新鲜组织切片脱脂且立即在LTQ Velos仪器上测量质量。观察到大部分上述多电荷离子。然而，未观察到具有分子量1830的肽且这种肽可能在脱脂期间已被去除。图134B1显示单次0. I秒采集，展示具有MW 11,788的蛋白质的多电荷状态分布。图134B2显示小鼠脑组织的另一区域的单次采集且展示MW 11,788的蛋白质的丰度低于丽17882的第二种蛋白质。多次扫描的质谱总和提供于图134A中。在图134A-B2中m/z 760附近观察到的离子是来自脂质。这些结果证明这种方法用于高空间分辨率组织成像的可能性。此外，不添加LSI基质的LSI-MS分析不会提供任何有用的分析结果。在沉积LSI基质后使用涂有金且平坦的显微载片可提供脱脂组织的类似丰度质谱。正如所料，在使用传导性或非传导性载玻片的AP LSI结果中未观察到质量位移。正如同老化组织一样，2，5-DHB优先检测脂质组分和2，5-DHAP蛋白质组分。图138A展示封埋于平坦的玻璃显微载片上且用2，5_DHAP处理的新鲜脱脂组织在使用LSI-MS进行激光烧蚀后的放大100倍的显微术，展示宽度< 3-8μπι且长度< 5-25 μ m的空间分辨率。与图138A中所见相比，图139A的使用涂有金的载玻片的新鲜脱脂组织在使用LSI-IMS进行激光烧蚀后的放大100倍的显微术提供略微更好的空间烧蚀。图138B描绘位于图138A的同一载玻片上且使用大致相同的激光聚焦、但使用2，5_DHB基质、使用10倍放大倍数的另一脱脂切片。图138B的显微术展示约200 μ m的空间分辨率。类似地，图139B描绘位于图139A的同一涂有金的载玻片上、使用大致相同的激光聚焦、但使用2，5-DHB基质、使用10倍放大倍数的另一脱脂切片。图138B的显微术展示约100 μ m的空间分辨率。显然，使用2，5-DHB，明显更难以获得较高空间分辨率和体积分析。不同实验条件的空间分辨率展现以下一般趋势2，5-DHB(涂有金且平坦的载玻片)>> 2，5-DHAP(涂有金且平坦的载玻片)>无基质(涂有金且平坦的载玻片)。
出于比较目的，使用封埋于涂有金且平坦的载玻片上的来自小鼠脑的依序组织切片进行真空MALDI-MS分析。用2，5-DHAP涂布各脱脂组织切片的一半且用SA涂布另一半，涂覆若干O. 2 μ I基质溶液。有趣的是，在使用2，5-DHAP的LSI与使用2，5-DHAP或SA的MALDI之间未见多电荷离子的相同分子量。使用2，5-DHAP基质的MALDI产生不良结果，其可有助于解释真空MALDI与LSI之间的差异。图140A和141A分别描绘涂有金的载玻片和平坦的载玻片上用溶于含0.1% TFA的50 50 ACN :水中的芥子酸点样的脱脂新鲜组织的MALDI-MS。图140B和141B分别描绘涂有金的载玻片和平坦的载玻片上用溶于50 50ACN :水中的2，5-DHAP涂布的脱脂新鲜组织的MALDI MS。D.讨论使用设定为100，000质量分辨率和< 5ppm外部质量精确度的Orbitrap Exactive质谱仪，从单次I秒采集(表示单次激光发射)，观察小鼠脑组织的质谱。图133中所示的质谱需要对表示大部分O. 2 μ L基质点的烧蚀的约15秒数据求平均值。如上述图134Α-Β2中所示，使用LTQ Velos质谱仪获得类似结果，但无质量分辨率。烧蚀区域的深度是在反射几何条件MALDI测量中难以获得的值，但却是组织重构所必需的信息。通过反射几何条件MALDI应用进行成像已显示烧蚀约50 μ m深度，以及大的深度和形状可变性；标准横向烧蚀为约ΙΟΟμπι。可变性可能是激光冲击角和聚焦不良的激光束，尤其是样品制备条件所致的结果，从而引入各分析的空间分辨率的测定不确定性。另一方面，SMS仅烧蚀上层(精确深度仍处于讨论中)；50μπι横向分辨率在商业上可用。然而，SMS使得许多生物分子产生明显断裂，并且离子产率随着m/z增加而快速降低，从而使得组织切片的分析极其困难。最新研究引入一种新的基于激光的成像技术，即激光烧蚀电喷雾电离MS,其提供活组织的具有350 μ m横向分辨率和50 μ m深度分辨率的深度分布。这些研究提供如下某种指示在反射几何条件布置下通过激光冲击烧蚀多少材料。大的烧蚀区域(体积)提供不良空间分辨率。烧蚀区域的可变性也可能是MALDI的不良定量性能的原因。据报导，使用真空MALDI，以聚焦透镜远离购得的肽和蛋白质标准物的烧蚀区域约12mm来实现5 μ m横向分辨率。离MALDI样品的所述短距离仅能通过在透射几何条件下使用激光束来实现。我们所测量的烧蚀值和已知的10 μ m组织切片厚度证明可实现< 300 μ m3的界限分明的空间体积。本发明研究中所用的点样基质的干液滴方法不适合于组织成像研究，因为预期提取到ACN:H20溶剂中的可溶性蛋白质在暴露于所涂覆的基于溶剂的基质的大部分区域内扩散。为减轻这个问题，我们使用无溶剂基质制备方法。在使用透射几何条件的LSI中烧蚀整个组织厚度的事实可以解释对于LSI和MALDI-MS所获得的不同质谱结果，其中后者仅烧蚀组织切片的表面区域。此外，根据从LSI-MS获得的烧蚀区域，溶剂/基质对组织的伤害和激光对组织的烧蚀的程度似乎在使用2，5-DHAP(相对于2，5-DHB)和使用脱脂组织(相对于未洗涤的组织)的情况下显著较小。需要解决的另一困难是激光束未穿透组织的激光烧蚀区域。这种情况似乎与不均匀的组织厚度和基质涂覆有关。未来的进展将需要改进的敏感度、使得每次激光发射穿透组织的条件和有效使所产生的气相离子的复杂性简单化的无溶剂气相分离即使使用TOF分析仪的当前成像质谱仪可提供超过10，000的质量分辨率和优于20ppm的质量精确度，这种质谱仪也不足以鉴别或甚至验证蛋白质结构。此外，由于蛋白质 离子的低电荷状态，通过诸如ETD等先进技术进行断裂并不适用。使用LSI方法，可实现MALDI的空间优点，以及API质谱仪的质量分辨率和精确度，和由于可产生类似ESI的多电荷离子而应用ETD和横截面分析的潜在能力。E.结论已报导在同时存在高空间和质量分辨率下直接从产生多电荷离子的组织观察到的肽和蛋白质的第一实例。实现单次激光发射采集和< 300 μ Hi3的烧蚀空间体积。多电荷离子的产生允许使用高效API质谱仪进行高质量分析，从而提供同位素分辨率和精确质量测量。多电荷离子可允许电子转移解离(ETD)断裂用于改进的蛋白质鉴别。使用激光直接从组织进行电离允许高空间分辨率用于质量特定组织成像。这种新方法存在与在组织成像中定位蛋白质有关的多种潜在应用。需要改进的敏感度、样品制备和激光聚焦来使这种技术发展到单细胞分析。II.实例 2这一实例描述使用两种脱溶剂化装置和其使2，5-DHAP基质脱除溶剂的能力进行的研究。使用由铜和不锈钢构成的脱溶剂化装置进行比较研究。这一实例中涵盖的其它研究描述通过应用脱溶剂化装置所获得的结果。Α.概述激光喷雾电离(LSI)是一种通过激光烧蚀基质/分析物混合物来产生多电荷离子的方法。在商业离子迁移率光谱法质谱法SYNAPT G2仪器上通过引入有效脱溶剂化条件来实现LSI。B.引言近来，在赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific) Orb i trap Exactive (马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默科技公司(Thermo Scientific, Waltham,MA))上引入激光喷雾电离(LSI)-质谱法(MS)。这种电离方法的原理是通过使用在大气压(AP)下操作的激光来烧蚀分析物/基质样品并且随后在脱溶剂化过程期间由多电荷基质/分析物簇形成离子。电荷状态选择的自由选择证明LSI对于使用类似于使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)获得的离子的单电荷离子和类似于通过电喷雾电离(ESI)产生的离子的多电荷离子分析复杂混合物的效用。后一种离子尤其有利于提供通过激光烧蚀诸如蛋白质和合成聚合物等较大分子进行电离且随后在高效但质量范围有限的仪器(诸如OrbitrapExactive)上分析多电荷离子的能力。在这一研究中，在商业离子迁移率光谱法(MS)SYNAPT G2仪器上展示LSI以使用如图84中所示的国产脱溶剂化装置分析蛋白质。与甚至高分辨率质谱仪相比，IMS-MS由于其扩大动态范围和分离异构组合物的能力而具有许多优点。IMS尺寸根据电荷和横截面(尺寸和形状)来分离离子。IMS具有无溶剂气相分离的益处并且使用无溶剂样品制备可完全消除电离、分离和质量分析与使用任何溶剂之间的关系，从而通过MS进行总无溶剂分析。C.方法 I.制造脱溶剂化装置使用1/8英寸外径、1/16英寸内径、3/4英寸长的铜和不锈钢管作为脱溶剂化室。所述管卷绕有24号镍铬合金线(科学试剂盒与北方实验室(Science Kit and BorealLaboratories),美国纽约州托纳旺达的科学试剂盒公司的分公司(Science Kit, Inc.,Tonawanda, NY, USA))和萨伟真(Saureisen)Pl 胶粘剂(Inso-lute 胶粘粉 Pl 号)以在所述线下方和上方施加绝缘和稳定性。所述管的出口端位置紧靠沃特斯(Waters)Z喷雾源的离子入口分离器。使用透射几何条件的氮气激光(光谱物理公司(Spectra Physics)VSL337 ND S)烧蚀基质/分析物样品，使用“干液滴”方法沉积于显微镜载玻片上。2.材料2，5-二羟基苯乙酮(DHAP)基质(98%纯度)、胰岛素(牛胰脏)、泛素(牛红细胞)、溶菌酶(鸡蛋清)、细胞色素C(马心脏)和肌红蛋白(马心脏)是购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich, Inc. , St. Louis, MO, USA),且血管紧张素1(人类)是来自美国多肽公司(American peptide)。乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、三氟乙酸(TFA)和乙酸溶剂是获自美国宾夕法尼亚州匹兹堡的飞世尔科技公司(FisherScientific Inc. , Pittsburgh, PA, USA)。使用纯水(美国马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore Corp.，Billerica，MA，USA))。显微载片(尺寸为I X 3英寸)是获自美国新罕布什尔州朴次茅斯的金密封产品公司(Gold Seal Products,Portsmouth,NH,USA)。3.样品制备血管紧张素、泛素、溶菌酶、细胞色素C和肌红蛋白的储备溶液个别地用纯水制备且胰岛素是用50 50 MeOH :水制备。使用基于溶剂的样品制备方案，使用用50 50ACN :水制备的2，5-DHAP基质，在载玻片上使用I μ L制备LSI样品，接着吹干到完成。将干LSI样品放在脱溶剂化装置的前面约I到3mm的距离处。对于ESI与LSI之间的比较，用49 : 49 : 2 ACN/水/乙酸制备泛素。E.结果展示使用所制造的脱溶剂化装置的基于激光的新颖电离方法。脱溶剂化装置的示意图可见于图84中。图84描绘在MS-MS SYNAPT G2上进行源修改以使得能够脱除在激光烧蚀期间所形成的基质/分析物簇的溶剂，从而获得类似ESI的多电荷离子。脱溶剂化装置可使用例如自耦变压器(Variac)来加热。对脱溶剂化装置施加热并非最终必需的。通过降低基质的热需求，也可以使脱溶剂化更有效地提高电离效率。2，5-二羟基苯乙酮(2，5-DHAP)可显示这种情况。可显示产生多电荷离子的基质的其它实例是2-氨基苯甲酰醇(ABA)和一些DHB异构体。也可使用挥发性基质和液体基质。研究两种脱溶剂化装置脱除2，5-DHAP基质的溶剂的能力。图85Α-Β展示从铜和不锈钢脱溶剂化装置获得的MS并且低质量蛋白质的信号强度不存在差异。图85(A)展示来自铜脱溶剂化装置的MS且图85 (B)展示来自不锈钢脱溶剂化装置的MS，其使用样品(I)血管紧张素(MW 1295)、(2)牛胰岛素(MW 5731)和(3)泛素(MW 8561)。使用溶于50 50ACN/水中的2，5-DHAP基质制备样品。图85A3展示铜使得较高质量蛋白质产生较高信号强度。图86描绘使用铜脱溶剂化装置且使用2，5_DHAP作为基质时以下物质的LSI-MS质谱1)血管紧张素I (MW 1295)、2)胰岛素(Mff 5731)、3)泛素(MW 8561)和4)溶菌酶(MW14300)，部分(A)中显示不使用热且部分(B)中显示施加额外的热(5V)。源温度为150°C。图86㈧(2)的质谱展示在不对脱溶剂化装置施加热(如图86⑶⑵中所见)的情况下蛋白质具有较高信噪比和较好质谱。
图87展示通过以下方法得到的泛素的MS-MS数据A)通过LSI和B)通过ESI。部分(I)描绘质谱，部分(2)描绘漂移时间相对于m/z的2D图，并且部分(3)描绘使用以下获得的不同电荷状态的漂移时间分布A)结合溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质的LSI;和B)使用49 49 2 ACN/水/乙酸的ESI。对于LSI，使用2，5-DHAP作为基质并且使用铜脱溶剂化装置在不施加热但使用设定为150°C的离子源温度的情况下获得数据。在5μ 7π η的流速和150°C的源温度下获得ESI。图87 (A) (I)和87 (B) (I)中的质谱电荷状态类似并且87 (A) (3)和87 (B) (3)中的漂移时间几乎一致，说明通过两种电离方法得到类似的气相离子结构。图88描绘的部分(I)描绘以下高质量蛋白质的质谱并且部分(2)描绘以下高质量蛋白质的td相对于m/z的2D图(A)细胞色素C (MW 12310)、⑶溶菌酶(MW 14300)和(C)肌红蛋白(MW 16952)，其是使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质制备并且使用铜脱溶剂化装置在不使用热的情况下获得。源温度为150°C。这些较高质量蛋白质显示LSI对于使用铜脱溶剂化装置在不施加热但使用150°C源温度的情况下获得MS-MS数据(图88 (2))的适用性。所述方法还用于分析β (1-42)与(42-1)的异构蛋白质混合物。图89描绘使用溶于50 50 ACN/水中的2，5-DHAP基质的β-淀粉样蛋白(1_42)与(42_1)的异构蛋白质混合物的LSI-IMS-MS，其使用铜脱溶剂化装置在不使用热的情况下获得。质谱，即部分(A)不区分两种化合物的存在，但td相对于m/z漂移范围瞬象的二维图，即部分(B)显然展示两种组分。部分⑶中的插图展示+4电荷状态的接近基线分离。与图117和118中分别分析的纯样品相比，二维漂移时间相对于m/z展示根据两种蛋白质的电荷数和横截面以及重叠位置的分离。如所选取的电荷状态+4的漂移时间分布(右下角)所示，蛋白质的电荷状态呈基线分离状态。β_淀粉样蛋白(1-42)因其低溶解度和高聚集趋势而众所周知并且在阿兹海默氏病的神经毒性空斑形成中起重要作用。由此可见，异构肽可使用LSI-MS-MS进行电离和分离；(1-42)具有更致密的结构，因为观察到其具有较快漂移时间。所述分析是使用2，5-DHAP作为基质来进行且除150°C离子源外不对热装置施加额外热。并且所述方法还用于分析阿兹海默氏病的非淀粉样蛋白组分(NAC)的总无溶剂分析。图90描绘使用2 JDHAP基质时阿兹海默氏病的非淀粉样蛋白组分(NAC)的LSI-IMS-MS总无溶剂分析，其是使用铜脱溶剂化装置在不施加热的情况下获得。部分(A)描绘质谱且部分(B)描绘2D时间漂移相对于m/z。漂移范围图说明在大气压下有效地直接从表面产生大的多电荷肽离子。较高电荷状态显示阳离子添加以及质子添加，类似于真空MALDI中的观察结果。较低电荷状态显示两种不同形状。F.结论制造简单脱溶剂化装置，其将通过激光烧蚀基质/蛋白质混合物所形成的多电荷基质/分析物簇转化为多电荷离子以用于具有低热和/或热能力的仪器，诸如沃特斯(Waters) IMS-MS仪器。在AP条件下使用这种制造的脱溶剂化装置产生多电荷LSI离子的成功证明了所提出的电离机制，即所述LSI类似于ESI。所述方法对于蛋白质混合物的无溶剂分散(分离)和使用MS-MS技术的总无溶剂分析的适用性对于组织成像应用极有前途。III.实例 3这一实例研究通过激光喷雾电离产生多电荷正离子和负离子以用于总无溶剂分 析的基质和基质制备方法。A.引言先前研究仅显示由基于溶剂的干液滴样品制备产生多电荷LSI离子。努力了解与在LSI中通过激光烧蚀MALDI MS中常用的基质所产生的类似ESI的多电荷离子的形成和电荷减少有关的过程。了解分析物并入基质中如何可主要产生多电荷离子和非并入产生所有单电荷离子，以及这是否适用于除2，5_ 二羟基苯甲酸外的基质，对于了解MALDI机制和开发新的改进的MS应用具有基本重要性。预期在涉及许多常见基质材料的这些研究中所得到的理解，以及产生多电荷正离子和负离子以用于TSA的发现将提供使用基于激光的AP电离仪器产生多电荷离子的改进。使用LSI研究无溶剂制备。B.方法研究常见MALDI基质2，5_ 二羟基苯甲酸(DHB)和2，5_ 二羟基苯乙酮(DHAP)，以及先前未使用LSI方法测试的基质，即2-氨基苯甲醇(ABA)、氨茴酸(AA)和2-羟基苯乙酮(HAP)0在基于溶剂的应用中，通过以7.7nmol μ L—1的浓度将分析物粉末(购自美国多肽公司(American Peptide Company Inc.))溶解于50 : 50 ACN :水中来制备血管紧张素I分析物。通过以90pmol μ L-1的浓度将牛胰岛素粉末(购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))溶解于50 : 50水MeOH中来制备蛋白质分析物。在载玻片(购自金密封公司(Gold Seal))上点样2 μ L分析物溶液，接着在上面点样2 μ L饱和基质溶液，混合并干燥。对于无溶剂制备，将10 μ L分析物(用50 : 50水MeOH溶液制备)倾倒于不锈钢珠粒上并在35°C下蒸发3小时以去除溶剂。接着使用TissueLyzer方法将固体分析物/基质混合物放在载玻片上。通过使用TissueLyzer直接混合血管紧张素I粉末与基质来制备包括ABA的样品。通过在载玻片上混合2 μ L分析物溶液与2 μ L基质来制备包括HAP的样品(在25°C下是液体)。所有样品都在透射几何条件下使用光谱物理公司(Spectra Physics) VSL337ND-S氮气激光烧蚀到用于离子迁移率光谱法(MS)-MS分析的改进的沃特斯(Waters)SYNAPT G2质谱仪或赛默公司(Thermo) LTQ-Velos质谱仪中。355nm Nd: YAG激光也用于显微术研究和HAP样品。所有基质都是购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)。C.结果展示在LSI中用于改进的多电荷离子形成的条件。图91A-B描绘来自LTQ-Velos的血管紧张素I的LSI质谱。在图91(A)中，饱和DHAP溶液(50 : 50水ACN)产生的+1离子多于+3离子。在图91(B)中，溶液升温且变得超饱和，从而在各2yL斑点中存在更多基质。这种方法产生具有与饱和溶液相比较高+3离子比率和较高总体离子强度的谱图。图92描绘来自ABA溶液(50 : 50水ACN)的单电荷和双电荷血管紧张素I负离子的LSILTQ质谱。放大的谱图展示对应于电荷的同位素分布。在碱性氨基酸取代基情况下，显示LSI可产生多电荷负离子。无氨基的基质仅产生单电荷负离子。对双电荷血管紧张素I正离子和负离子的漂移时间分布的观察结果揭露，在不考虑是什么基质产生所述离子的情况下，负尚子具有较慢漂移时间且正尚子具有相同漂移时间。图93揭露-2尚子比+2尚子移动得略慢并且在不考虑使用什么基质的情况下+2离子显示相同漂移时间。展示多电荷离子的丰富产生，其中30Hz的研磨频率对于分析物并入基质中为最佳。图94A-C描绘通过DHAP使用TSA产生多个电荷。图94(A)描绘在25Hz下研磨10分钟仅产生+2电荷。图94⑶描绘在30Hz下研磨10分钟产生+2与+3电荷，其中+3具有最高相对丰度。图94 (C)描绘30Hz研磨能够将牛胰岛素并入DHAP晶体中以使得在强的2维漂移时间图中实现高达+7的电荷状态。 也通过使用有机液体基质将分析物溶解于基质自身中来产生多电荷，但如图96中所示，用HAP基质(在25°C下是液体)烧蚀的血管紧张素I的谱图显示仅使用355nm波长的Nd/YAG激光实现结果。图95所展示的图指示由无溶剂制备的各基质产生的最高血管紧张素I电荷状态(+2到+3)的比率与超过五分钟的研磨时间成反比。当制备无溶剂样品时，显示当研磨10分钟而非5分钟时，各基质混合物产生较小高电荷比。最后，定性显微术研究揭露当如图98中所示以较高通量使用355nm Nd: YAG激光时，形成熔融DHB/分析物液滴，这与如图97中所示的来自337nm氮气激光的极少熔融材料相反。通过337nm激光烧蚀的DHB的无溶剂LSI实验仅产生单电荷。通过355nm激光烧蚀的DHB的无溶剂LSI实验产生多电荷离子。另外，显示在使用氮气激光的基于溶剂的ABA实验中无熔融烧蚀并且与使用355nm Nd/YAG激光形成的大量熔融材料形成对比。图99描绘通过337nm激光烧蚀的ΑΒΑ。这种激光在破坏ABA的晶体结构方面有困难，因此所产生的用于基于溶剂的LSI实验的信号低得多。图100描绘通过355nm激光烧蚀的ΑΒΑ。与基于溶剂的LSI实验中的337nm相比，这种激光产生好得多的多电荷信号，因为较高激光通量允许形成熔融基质/分析物液滴。D.结论了解哪些LSI条件使得产生丰富的多电荷离子对于改进MS应用极其重要。无溶剂多电荷产生可使LSI断裂技术扩展到溶解度有限的分析物，并且负离子的形成可改进更加倾向于脱质子化而非质子化的分子的分析。IV.实例 4这一实例描述使用TissueBox/SurfaceBox装置将无溶剂MALDI基质沉积于表面所产生的样品的无溶剂MALDI研究和结果。A.通用方法对于球磨，不锈钢珠粒(I. 2mm)和铬珠粒(I. 3mm)是购自俄克拉何马州巴特尔斯维尔的比奥斯派斯制品公司(BioSpec Products, Inc. Bartlesville, OK)。3 μ m和 20 μ m 目的材料A是购自明尼苏达州明尼阿波利斯的工业网织品公司(Industrial Netting, Inc.,Minneapo I is, MN)，并且20 μ m的材料B是购自马里兰州哥伦比亚的霍琴托格拉股份有限公司(Hogentogler & Co, Inc. Colombia, MD)。基质，即 α -氛基-4-轻基-肉桂酸(CHCA)和2，5_ 二羟基苯甲酸98% (DHB)是购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich, Inc.，St. Louis，MO)。溶剂，即乙腈(ACN)和三氟乙酸(TFA)是购自宾夕法尼亚州匹兹堡的飞世尔科技公司(Fisher Scientific Inc.，Pittsburgh, PA)。使用纯水(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore’s Corporate,Billerica,MA))。平坦的显微载片(尺寸为I英寸X3英寸)是购自新罕布什尔州朴次茅斯的金密封产品公司(Gold SealProducts, Portsmouth, NH)。使用用于成像的涂有ITO的传导性载片(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克公司(Bruker, Billerica, MA))。喷枪(1/5马力、100PSI压缩机和喷枪套件)是获自加利福尼亚州卡马里奥的中心气动专业公司(Central Pneumatic Professional,Camarillo, CA)。使用塑料真空密封食物容器在不干扰组织/基质组合物的情况下进行样品运输和解冻，这种容器是购自伊利诺斯州斯科基的ZeVRO公司(ZeVRO，Skokie, IL)。I.小鼠脑组织 使18周龄的C57 B1/6小鼠麻醉并且用冰冷的I X磷酸盐缓冲生理盐水(150mMNaCl、IOOmM NaH2PO4, pH = 7. 4)经贲门灌注5分钟以去除红细胞。将脑冷冻在-20°C下且使用莱卡CM1850冷冻切片机(伊利诺斯州班诺克本的莱卡微系统公司(LeicaMicrosystems Inc. , Bannockburn, IL))依次切割成 10 μ m 切片。在各别 MALDI-TOF-MS 和MALDI-IMS-MS研究中，使用来自同一小鼠的切片，但在用于分析的两种不同类型的质谱仪之间动物是不同的。将切片放在预冷却的载片上。简单地用手指从背面使载玻片加温以使得切片松弛并附着。小心避免水冷凝。将载片在_20°C下储藏于含有干燥剂的气密盒中直到使用为止。2.用于快速无溶剂基质沉积应用的SurfaceBox :设计和制造设计并制造用于无溶剂MALDI基质沉积于表面的装置。图18展示这种装置的设计原理，其由紧密地固定但具有足够距离(约Icm)以使得通过球磨装置(TissueLyzer)能够实现珠粒的用力移动和筛网的可能弯曲不会伤害组织切片的两个隔室组成。上隔室是以筛网(20μηι或3μηι)面向下隔室的形式安装。将各别基质材料和珠粒添加到SurfaceBox的上隔室中。所述珠粒以及所需基质材料保留在SurfaceBox的上部部分中。将固持面向上隔室的组织切片的显微载片以足够距离放在下隔室中并且通过在SurfaceBox的侧壁中开槽或简单地通过在显微载片的底部使用双面胶带而固定于下隔室。SurfaceBox被设计成防止显微载片外的基质污染。通过用力移动SurfaceBox,使用不需劳力且灵活的TissueLyzer装置来进行各别基质材料的涂覆。B.小鼠脑组织的MS分析I.无溶剂 MALDI 分析MALDI_T0F 仪器将粘着于ITO载玻片(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))的冷冻小鼠脑组织切片放入干燥氮气室中20分钟,此时组织解冻。在2400dpi的分辨率下使用爱普生(Epson)扫描仪(爱普生(Epson)Perfection4490 Photo)得到组织的数字图像。将组织放入Autoflex III MALDI TOF仪器(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc.，Billerica, MA))中，并且在FlexImaging 2. I软件(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))中使用三个教示点记录样品台的xy位置。在测量500Da到2000Da的质量范围的正离子、反射模式下操作仪器。所有固态智慧式(smartbeam)激光都在200Hz的重复频率下操作，并且激光束直径调整到50 μ m。成像光栅分辨率也设定为50 μ m以提供高空间分辨分子图像。手动确定小鼠脑的一部分(2mmX5mm)以用于成像实验，采集到超过3600个谱图。从每一像素总和总共200次激光发射。完成分析后，使用FlexImaging通过基于疑问信号的检测和强度以颜色梯度呈现各体素的分子详情来处理结果O2.将SurfaceBox应用于使用TissueLyzer的快速无溶剂基质沉积。使用TissueLyzer (加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(QIAGEN, Valencia, CA))和设定频率(在本文中为15Hz和25Hz)在含有珠粒材料的5mL玻璃小瓶中预研磨大量储备基质材料(约Ig)并持续固定时间(在本文中为5分钟和30分钟)。在一组实验中，使用30-50个铬珠粒(I. 3mm)。在第二组中，使用20-30个不锈钢珠粒(I. 2mm)以及3个4mm珠粒。3基质转移条件的评估将预研磨的基质(CHCA、DHB)以及3个大(4mm)不锈钢珠粒和10到20个小(I. 2mm)不锈钢珠粒放在SurfaceBox的上隔室中。将封埋有小鼠脑切片的显微载片放在下隔室中。接着将组装的SurfaceBox装置放在TissueLyzer样品固持器中并固定于TissueLyzer臂上。在25Hz的设定频率下组织切片的基质厚度由时间(30秒到5分钟)控制。对于具有20 μ m孔隙的筛网材料，在60秒内获得DHB和CHCA基质材料的均匀覆盖。对于具有3μπι孔隙的筛网材料，球磨时间增加到5分钟(DHB、CHCA基质)。两种不同基质材料(DHB、CHCA)也涂覆于位于一个显微载片上的两个不同组织切片上。简单地通过仅在基质涂覆范围内移动各别切片来进行两个后续基质涂覆循环。可通过将两个SurfaceBox放在TissueLyzer固持器中来实现多路复用(multiplexing)(可在补充信息(SupplementalInformation)中得到照片)。
4.用于基于溶剂的基质沉积的喷涂根据先前报导的程序(加勒特(Garrett)等人，国际质谱学杂志(Int. J. MassSpectrom) 2007，260，166-176)，使用喷枪将基于溶剂的基质涂覆于组织切片上，所述文献中有关所述程序的教示以引用的方式并入本文中。简单来说，将基质(CHCA)溶解于含0. 1% TFA的50 50 ACN/水溶液中并且以12cm到15cm的距离使用喷枪喷洒于封埋于载玻片上的组织切片上。将总共20个基质溶液涂层涂覆于各组织切片上。基于溶剂的基质涂覆方案对于所有样品都保持不变，因此并非对于所有样品都是最佳的。5.显微术使用光学显微术(尼康(Nikon)，ECLIPSE, LV)提供对沉积于载玻片上的基质和基质覆盖的组织，以及纯组织和不同筛网的定性了解。使用各种放大倍数条件(5倍到100倍)，从而提供降低到约1-10 μ m的详图。在日立(Hitachi) S-2400扫描电子显微镜上进行扫描电子显微术(SEM)分析。对于SEM研究，将碳带放在基质覆盖的组织上以获得SEM样品。将SEM样品放在SEM样品固持器中并在各种放大倍数下进行分析。6.样品的制备和储藏
将MALDI基质制备的组织样品牢固地放在塑料真空密封食物容器中并略微排气以去除空气中所含的水分。将样品容器在_80°C下保持一个夜晚并放在干冰上。在使用之前，从干冰上移出容器并使容器升温到室温，随后释放少量真空密封。一天(对于MALDI-T0F)和六天(对于MALDI-MS-T0F)后获得质量测量结果。C.小鼠脑组织的MS分析I.无溶剂 MALDI 分析MALDI_T0F 仪器将粘着于ITO载玻片(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))的冷冻小鼠脑组织切片放入干燥氮气室中20分钟,此时组织解冻。在2400dpi的分辨率下使用爱普生(Epson)扫描仪(爱普生(Epson)Perfection4490 Photo)得到组织的数字图像。将组织放入Autoflex III MALDI TOF仪器(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(Bruker Datonics, Inc.，Billerica, MA))中，并且在FlexImaging 2. I软件(马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克·达托尼克斯公司(BrukerDatonics, Inc. , Billerica, MA))中使用三个教示点记录样品台的xy位置。在测量500Da 到2000Da的质量范围的正离子、反射模式下操作仪器。所有固态智慧式激光都在200Hz的重复频率下操作，并且激光束直径调整到50 μ m。成像光栅分辨率也设定为50 μ m以提供高空间分辨分子图像。手动确定小鼠脑的一部分(2_X5mm)以用于成像实验，采集到超过3600个谱图。从每一像素对总共200次激光发射求和。完成分析后，使用FlexImaging通过基于疑问信号的检测和强度以颜色梯度呈现各体素的分子详情来处理结果。2.总无溶剂分析(TSA) MALDI-IMS-MS 仪器在成像实验之前使用CanoScan 4400F扫描仪(英国赖盖特的佳能公司(Canon,Reigate, U. K.))获得组织切片的数字扫描并且输入MALDI成像图案制作软件(英国曼彻斯特的沃特斯公司(Waters Corporation, Manchester, U. K.))中，选择其中待成像的区域。使用以IMS模式操作的MALDI SYNAPT HDMS (英国曼彻斯特的沃特斯公司(WatersCorporation, Manchester, U. K.))获得MALDI-IMS-MS分析。使用聚乙二醇的标准混合物(英国格林厄姆的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich, Gillingham, U. K.))进行仪器校准，范围在m/z 100与1000之间。在以超出100-1000的m/z范围的HDMS模式操作的MALDISYNAPT HDMS上，使用200Hz Nd: YAG激光获得组织成像数据。选择150 μ m的空间分辩率，并且每个像素获得400次激光发射。用于离子迁移率分离的气体是氮气，其流速设定为22mLmin—1。MS装置中的压力为5· 07 Χ10—1毫巴。MS波速设定为300ms—1，其中能够实现可变波高。波高设定为6V到14V。采集后，使用MALDI成像转换器(英国曼彻斯特的沃特斯公司(Waters Corporation,Manchester, U. K.))将数据转换为分析文件格式以使用BioMap (瑞士巴塞尔的诺华公司(Novartis,Basel,CH))进行图像分析。也可使用DriftScope 2.1(英国曼彻斯特的沃特斯公司(Waters Corporation, Manchester, U. K.))评估数据,其中可观察m/z相对于漂移时间的2-D图。在本文中，应用“峰值检测”算法以产生峰值列表，可将其载入Excel中，在其中报导m/z、强度和漂移时间。因此，可鉴别具有类似m/z (同重元素)和不同漂移时间(迁移率)的种类，如对于m/z 863. 5的一组低丰度同重种类所示。可从DriftScope 2. I选择和选取个别离子种类,用其X和Y坐标保留特定m/z和漂移时间。接着可转换所选取的原始数据以用于BioMap。输出仅呈现所关注离子的离子图像。使用TissuLyzer制备多种无溶剂样品。分析那些样品并将结果展示于图1_14中。图I展示用于获得图2-14(七种肽、两种小蛋白质和四种脂质)中所示的图像的基质(2，5-DHB)/分析物混合物的照片。使用TissueLyzer (10分钟，频率为20Hz)制备无溶剂样品以进行均质化并将粉末直接转移到MALDI板(左边)。为确保满足两种不同电离方法之间相同的基质/分析物条件，将无溶剂制备的基质/分析物样品留在容器小瓶中的一部分溶解于50/50乙腈/水中并且点样于MALDI靶板上，随后蒸发溶剂，得到基于溶剂制备的样品(右边)。这种确定的模型混合物覆盖各种不同化合物类别(肽、小蛋白质和脂质)、分子量(378. 6到5733. 5Da)、溶解度/疏水性[例如牛胰岛素(可溶)相对于β -淀粉样蛋白(1-42)(不溶)；β -淀粉样蛋白(1-11)(亲水性)相对于β -淀粉样蛋白(33-42)(疏水性)];和电离[例如2-AG相对于NAGABA ；ΡΙ相对于PC]以示范活组织中存在的简单挑战。也使用其它基质(例如α -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))。使用MALDI-T0F/T0F仪器(布鲁克公司(Bruker))使两种不同制备样品(使用和不使用溶剂)成像。对于无溶剂制备，所得成像通过离子丰度测量展示基质中的均质样品分布，这与基于溶剂的制备相反。左侧图像是无溶剂且右侧图像是基于溶剂，如对于确定的模型混合物中的肽、小蛋白质和脂质所说明各种不同化合物类别(肽、小蛋白质和脂质)、分子量(378. 6到5733. 5Da)、溶解度/疏水性[例如牛胰岛素相对于β _淀粉样蛋白 (1-42) ;β-淀粉样蛋白(1-11)相对于β-淀粉样蛋白(33-42)];和电离[例如2-AG相对于NAGABA ；ΡΙ相对于PC]。甚至类似的化合物和分子量[例如图2 (m/z 915. 2)到11 (m/z2846.5)中按渐增分子量排序的肽]使用基于溶剂的电离方法(右)也只产生低再现性结果，然而无溶剂方法在整个样品中产生类似离子丰度(左)。使用利用具有各种性质的各种化合物的无溶剂样品制备(左侧图像)，分析物的离子信号在整个样品中相当恒定，然而使用基于溶剂的方法(右侧图像)，离子信号极不均匀。图2-14展示使用无溶剂和基于溶剂的分析来分析若干种蛋白质、肽和脂质。图2描绘β_淀粉样蛋白(33-42 ;MW 915.2)的无溶剂和基于溶剂的分析。图3描绘促脂解素(MW 951. I)的无溶剂和基于溶剂的分析。图4描绘加压素(MW 1084.3)的无溶剂和基于溶剂的分析。图5描绘强啡肽(MW 1137.4)的无溶剂和基于溶剂的分析。图6描绘β -淀粉样蛋白(1-11 ;MW 1325.3)的无溶剂和基于溶剂的分析。图7描绘物质P (MW1347. 8)的无溶剂和基于溶剂的分析。图8描绘蜂毒肽(MW 2846.5)的无溶剂和基于溶剂的分析。图9描绘淀粉样蛋白(1-42 ;丽4511)的无溶剂和基于溶剂的分析。图10描绘牛胰岛素(MW5733. 5)的无溶剂和基于溶剂的分析。图11描绘2-花生四烯酰基甘油(2_AG) (MW 378. 6)的无溶剂和基于溶剂的分析。图12描绘N-花生四烯酰基Y氨基丁酸(NAGABA) (MW 389. 6)的无溶剂和基于溶剂的分析。图13描绘磷脂酰肌醇(PI) (MW 909. I)的无溶剂和基于溶剂的分析。图14描绘磷脂酰胆碱(PC) (MW 760. I)的无溶剂和基于溶剂的分析。V.实例 5这一实例描述旨在实现欲用于SurfaceBox中以改进组织切片的覆盖的基质晶体的尺寸的均匀减小的研究。A.基质涂覆图18描绘适合用于使用MALDI的成像质谱法的TissueBox的示意图。所述TissueBox可通过在同一固持器中添加更多组织切片或更多盒，接着可使用不同基质来实现多路复用。所示部分包括固持基质材料、筛网和金属珠粒的SurfaceBox上隔室；和包括组织切片和载玻片的下隔室。TissueBox包括具有基质和珠粒和孔隙为约44 μ m的筛网底部的可套盒。固持盒可包括位于载玻片上的组织样品。各组件以紧密配合套在一起，从而使得具有足以保持筛网分隔的间距。球磨机允许为内含物的用力移动选择频率和持续时间，如本文中使用所制造的SurfaceBox的情况。这转而又提供改变推过筛孔的材料的量(由此对应于组织切片表面上的基质厚度)的极其容易且简单的方法。所述方法较快，操作者干预极小且产生晶体尺寸介于< I μ m与30 μ m之间的均匀覆盖的经历视所用筛网而定(使用44 μ m筛孔的来自组织的SEM数据)。图22A-B描绘用44微米筛网球磨(DHB基质，在25Hz下30秒)后的基质晶体尺寸。图22A展示放大100倍(500 μ m比例尺)和放大100倍的插图(50 μ m比例尺)。图22B展示使用扫描电子显微术(SEM)放大3000倍的10 μ m比例尺。研究实现欲用于SurfaceBox中的基质晶体的均勻减小的条件。图36涉及适当晶粒尺寸的重要性。图36展示放大6000倍、使用5μηι比例尺、使用以下TissueLyzer条件时使用(I)铬珠粒和(2)不锈珠粒的显微术扫描(A) 15Hz频率持续30分钟和(B) 25Hz频率持续5分钟。含有I. 3_铬珠粒的小瓶中的预研磨基质的光学显微术结果显示与不锈钢 珠粒相比，实现晶体尺寸的有效和均匀减小。如图36(1) (A)中所示，基于所获得的最小和均质晶体尺寸(尺寸< I μ m到5 μ m的绒毛状非结晶材料)，使用较重铬金属珠粒持续较长研磨时间可产生最好的结果。为实现均一晶体覆盖，评估减小将用于SurfaceBox装置中的筛孔(20 μ m和3 μ m)的条件。为使得基质层的个别晶体尺寸更明显，在空显微载玻片上且使用较短研磨时间进行比较以避免妨碍评估的较厚基质层。图24-27展示DHB或CHCA的光学显微术图像。图24和25提供在25Hz/60秒下根据20 μ m筛网的DHB的光学显微术图像，提供IOym的放大比例尺。图26提供在25Hz/60秒下根据20 μ m筛网的DHB的光学显微术图像，提供10 μ m的放大比例尺。图27展示使用安装有不同筛网尺寸和不同不锈钢珠粒(1.2_和4_)的混合物的SurfaceBox且使用25Hz频率和5分钟持续时间、使用3 μ m筛网转移基质的TissueLyzer设定沉积于空显微载片上的CHCA基质的光学显微术图像。使用图36(1) (A)中测定的减小且更均质的晶体尺寸以及安装有20 μ m筛网材料(材料A)的SurfaceBox提供< I μ m到12 μ m的DHB晶体尺寸和介于约I μ m与12 μ m之间的CHCA。差异似乎是DHB具有大量约I μ m和更小的晶体，以及显著较大(3-12 μ m)的第二尺寸晶体。在CHCA的情况下，小晶体和大晶体的可变性较不显著，其中晶体范围主要为约I μ m到3 μ m，仅少数达到12 μ m。基质涂覆方法的简单性预示使用具有甚至更小孔隙的筛网制备样品。在最后一项实验中，研究3μπι筛孔的适用性。3 μ m材料的构造类似于20 μ m材料Α。为改进组织切片的覆盖，使用TissueLyzer用力振动SurfaceBox的持续时间在25Hz的频率下增加到5分钟。这些条件产生如图27中所示范的均质尺寸晶体的极均一覆盖。观察到介于< Iym与5 μ m之间的CHCA晶体。图37-39展示使用SurfaceBox沉积于小鼠脑组织切片上的DHB基质的光学显微术图像并提供在25Hz/300秒下根据44X 3 μ m筛网的DHB的光学显微术图像。使用不同不锈钢珠粒(I. 2mm和4mm)的混合物。图37展示使用透射光和200 μ m的放大比例尺的光学显微术图像。图38展示使用反射光和IOOym比例尺的光学显微术图像。图39展示使用反射光和10 μ m比例尺的光学显微术图像。图40展示在25Hz/300秒下根据44X3 μ m筛网的DHB的SEM图像，提供5μπι的放大比例尺。与单筛网TissueBox(图23)相比，双筛网TissueBox提供小于< 5um的粒子的显著增加(比例尺在右下角)。对于沉积于组织上的基质(这里为DHB)所获得的结果显示于图37和图40中。由使用透射光显微术(200μπι比例尺)的图37可见，使用3μπι筛网的组织覆盖总体均匀；在反射光情况下，基质呈现为暗点。使用放大图(图40，5μπι比例尺)的反射光指示先前对于空载玻片所观察到的类似均匀性(图27，CHCA)。数据表明基质包括于组织表面上，其可能是通过用力移动TissueLyzer臂而可能实现的速度的结果。在本文所用的条件下，与基于溶剂的基质涂覆相比，均匀性得到改进。因此，实现小鼠脑组织切片的均匀基质覆盖(DHB)。对于图28A-C中所示的组织MS成像研究使用20 μ m材料A。图28A-C比较使用(I)快速无溶剂SurfaceBox基质沉积(左侧图像)和⑵喷涂(右侧图像)和CHCA基质时小鼠脑组织的组织成像。图28A展示用CHCA基质覆盖的组织，图28B展示质谱，且图28C展示各别m/z值对于无溶剂为(I) 779. 6和(II) 843. 3且对于基于溶剂为(1)726.3和(11)804.3。将使用快速无溶剂基质(这里是CHCA)涂覆于小鼠脑切片所获得的MS组织成像结果与喷涂方法作比较。(加勒特(Garrett)等人，国际质谱学杂志(Int. J. Mass Spectrom) 2007，260，166-176)。使用这一程序，当以细雾形式涂覆饱和CHCA溶液时，基于溶剂的涂覆产生约5-50 μ m的晶体尺寸。使用MALDI-T0F仪器采集到的数据对于使用50 μ m横向分辨率和刚好高于基质临界值的激光功率的两个组织切片来说保持一致。在图28中，(A)中展示各小鼠脑切片的成像区域以及(B)中展示典型质谱，且(C)中展示分别由各方法获得的重叠离子图像。较丰富离子的m/z (图28B)对应于含钾磷脂酰胆碱，例如m/z 772(32:0)和 m/z 798(34:1)。显示m/z值以及击中次数的重叠离子图像，其提供诸如m/z 779. 6和726. 3以及m/z843. 3和804. 3的互补图像。使用基于溶剂和无溶剂样品制备来检测不同离子并非出乎意料。所述方法与无溶剂样品制备互补，其较好地电离疏水性和溶解度有限的化合物。从组织变化获得脂质信号视基质选择、溶剂系统和极性而定(施瓦兹(Schwartz)等人，质谱学杂志(J. Mass Spectrom) 2003, 38,699-708)。脂质概况和信号强度在两种样品制备之间不同。选择具有足够离子强度的个别离子来提供可见分子图像，并在同一样品制备中形成互补对。在这一实例和图28A-C中重要的是均匀反应而非m/z值或离子信号强度。对离子图像进行彩色编码以说明构成整个图像的各质谱中的离子强度。离子图像中针对相同m/z值的相同颜色的均匀分布指示具有几乎相同离子强度的质量信号。如例如通过具有相同颜色的大片区域(图28、1、C)可见，使用无溶剂MALDI分析获得均匀离子信号反应。基于溶剂的MALDI分析(图28、2C)展示信号强度变化的随机变化，例如在主要是绿色(中等丰度)的一片中的红色(高丰度)和蓝色(低丰度)像素。离子信号强度变化可归因于MALDI分析中通常发生并且限制MALDI组织成像应用的热析点(sweet spot)。这一比较指示高分辨率图像可使用SurfaceBox进行快速基质涂覆和高分辨率图像分析来获得。使用MALDI-T0F-MS仪器进行组织成像的先前无溶剂涂覆使用100 μ m横向分辨率。(波利泰瓦尔(Puolitaival)等人，美国质谱学会杂志(J. Am. Soc. Mass Spectrom) 2008,19,882-886)。VI.实例 6
这一实例描述使用FF-TG-AP MALDI分析小鼠脑组织。还描述无溶剂和基于溶剂的基质涂覆的比较。A.小鼠脑的组织质量分析 图43A-B展示使用无场透射几何条件大气压(FF_TG_AP) MALDI源进行小鼠脑的组织质量分析，所述小鼠脑是通过将基质放在组织与载玻片之间来制备。图43(A)展示通过对纯的组织斑点取样所获得的总离子流并且图43 (B)展示质谱。插图指示使用高质量分辨率仪器(50000质量分辨率，< 5ppm质量精确度)描述的同重组合物。这种FF设计能够用TG-AP源烧蚀组织与基质层。组织与基质厚度都可以准确地测定和优 化。如下文详细讨论，图44展示具有通过喷洒干材料且随后进行激光烧蚀而用DHB覆盖的脑切片的显微载片的照片。图44展示具有如下脑切片的显微载片(I)通过直接从容器中喷洒干材料且随后进行激光烧蚀而用DHB覆盖；和(2)基于溶剂搀入四滴DHB基质。图45和46展示激光烧蚀后图44的经无溶剂基质处理的组织切片的光学显微术图像；在图45 (放大比例尺为50 μ m)中，凹坑的形状指示成功地激光烧蚀穿过组织；在图46 (放大比例尺为ΙΟμπι)中，包围凹坑的其余基质指示基质有助于组织的烧蚀。图47描绘激光烧蚀后图44(2)的经无溶剂基质处理的组织切片；暴露于O. 2μ L基质的区域呈现黑色。在发射激光产生离子后，通过光学显微术检查组织切片上的基于溶剂和无溶剂基质涂覆。用DHB基质覆盖组织切片以使得激光束穿过组织，随后达到基质。所述基质证明在这种布置中组织材料电离，但程度比使用组织与显微镜载片之间的基质要小。组织上的激光冲击是肉眼看不到的。光学显微术检查揭露组织广泛冲击事件。图45和46中展示两种区域。图45展示图44的经无溶剂基质处理的组织切片且可将这些切片与图47中所示的基于溶剂的涂覆的结果作比较。图45中的较大冲击区域指示烧蚀组织区域(约80 μ m)的形状。如通过烧蚀组织的周围隆起可见，观察到组织损伤。图46中所示的两个烧蚀区域中的较小者指示基质的可能作用。仅当基质充分接近组织时，基质才会有助于组织分子的解吸/电离。可能的机制是在第一次发射后，热量使基质熔化到组织上。这将解释具有一部分基质晶体的烧蚀组织区域仍存在于凹坑的每一侧上。当基质位于组织下方时，实现显著较好的离子流；然而，经激光烧蚀的组织区域显著较大。用FF-TG-AP方法产生的离子丰度表明使用改进的激光束聚焦可观察到足够信号。VII.实例 7这一实例展示血管紧张素I的无溶剂MS分析。对于MALDI样品制备，按照干液滴方法(卡拉斯(Karas)等人，分析化学(AnalChem) 1998 ;60 :2299)。使用曲姆宾(Trimpin)等人，质谱学快讯(Rapid Commun MassSpec) 2001 ；15 :1364中所述的方案制备将样品直接沉积于载玻片上的无溶剂样品制备物。肽、蛋白质、DHB异构体和溶剂是获自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St. Louis, MO)) ο图62展示通过LSI使用2，5-DHB所获得的血管紧张素I的质谱。插图展示如所指示的扩大区域。图63展示通过电喷雾电离(ESI)使用50/50CAN/水所获得的血管紧张素I的质谱。结果显示对于诸如血管紧张素I等小系统，在ESI与使用2，5-DHB和基于溶剂的样品制备条件的FF-TGAP-MALDI之间观察到相同电荷状态分布和丰度。VIII.实例 8这一实例展示经电离的淀粉样蛋白肽(1-42)的AP-MALDI。淀粉样蛋白肽(1-42)在阿兹海默氏病的发病机制中起重要作用。作为疾病过程的一部分，其是转化成不溶性神经毒性β_淀粉样蛋白原纤维形式(文德林(Wunderlin)等人，妝-欧洲研讨会(Peptides-European Symposium) 1999 ;25 ;330_331)。对于这一实例，对淀粉样蛋白(1-42)进行AP穿过阶段MALDI。因为蛋白质分子量超过标准MS范围,所以蛋白质被电离。图65-67展不电荷+4、+5和+6的质谱。这一实例展不电离较大分子量蛋白质(超过约4，OOOmw)可允许使用AP穿过阶段MALDI对其进行分析。IX.实例 9这一实例展示牛胰岛素的制备和MS分析。
使用2，5-DHB和MALDI基于溶剂的基质/分析物制备方法，产生牛胰岛素的质谱。(卡拉斯(Karas)等人，分析化学(Anal. Chem.) 1988 ；60 :2299)。MALDI 质谱(图 68)类似于胰岛素的ESI谱图。图10展示牛胰岛素的无溶剂和基于溶剂的制备。X.实例10.其它数据和揭示内容以下各图呈现与旨在通过质谱法(MS)改进材料分析和组织成像的研究和实验有关的其它数据和揭示内容。图15描绘根据形状的同重分子的无溶剂分离。MS-MS根据电荷数和横截面(尺寸和形状)来分离分子；半乳糖和阿司匹林(aspirin)具有基本上相同的分子量(基本上相同的尺寸)并且通过添加一个阳离子(相同的电荷数)来电离。图15展示使用半乳糖(C6H1206 ;精确分子量为180. 063Da)相对于阿司匹林(C9H804 ;精确分子量为180. 042Da)的ESI-MS-MS(SYNAPT G2，沃特斯公司(Waters Company))的漂移时间谱图(无溶剂分离，尚子迁移率输出)。图16描绘根据形状的异构分子的无溶剂分离。IMS-MS根据电荷数和横截面(尺寸和形状)来分离分子；N-AEA(大麻素；药理学相关化合物，一种内源性大麻素样物；与脑功能和健康(幸福)有关；花生四烯酸和乙醇胺通过胺官能团连接在一起得到酰胺键)和0-ΑΕΑ(大麻素；可能药理学无关化合物；花生四烯酸和乙醇胺通过醇官能团连接在一起得到酯键)具有相同分子量(相同大小)并且通过添加一个阳离子(相同电荷数)来电离。图16 展示使用 O-AEA相对于 N-AEA 的 ESI-MS-MS (SYNAPT G2，沃特斯公司(Waters Company))的漂移时间谱图(无溶剂分离，离子迁移率数据)。插图谱图是N-AEA和O-AEA的质谱(MS输出)，提供[M+H] +质荷比(m/z)为348. 28的丰富离子。由于其分子量和电荷相同，因此这些离子无法以MS尺寸来区分(仅根据m/z分离)。图17提供样品制备和反射几何条件(RG)MALDI的流程，其展示与组织材料的分析尤其有关的问题。将组织放在样品固持器上并涂覆基质。将激光引导到基质和样品上，从而引起组织分子的解吸和电离。图17特别展示其不适宜用于未完全囊封组织样品的基质材料。RG MALDI是目前销售的真空和大气压MALDI质谱仪中仅用的源几何条件。最左边的图像展示表面(通常是涂有金的载玻片、金属板或可固持载玻片的金属板)上的组织材料。为使转移到气相中的分子完整并附着电荷，对于较大分子尤为关键的是，必须使用辅助分析物的解吸和电离的基质。上部中间的图像显示理想情况并且下部中间的图像显示当使用基于溶剂的涂覆方法涂覆基质时的实验事实；打乱和搅乱各种化合物在组织切片中的定位以使得其丢失其原始且天然的环境和位置。上部右边的图像展示在气相下产生完整分子离子的RG MALDL· UV激光(通常为355nm[N2激光]、355nm[Nd:YAG激光])从‘正面’并以一定角度激发基质(在横向和深度尺寸上限制对烧蚀区域的控制)。通过施加电压来使产生的离子从表面上升以使其加速离开并到达通常根据m/z分离分子的分析器中。图19描绘TissueBox的一个图的照片。展示用于组装图18中所描绘的TissueBox的已制造部分。左侧图像展示在底部固持筛网(通常是金属或塑料，具有各种‘孔’尺寸，>44到Ιμπι)的上隔室。这一上隔室在组装时用基质和珠粒(通常是不锈钢、玻璃、铬且典型尺寸范围为0.5_到5_)填充。右侧图像展示在底部固持载玻片(封埋有两个组织切片)的下隔室，且当与上隔室组装时，所述隔室被设计和制造成使得组织与筛网之间存在足够间距，从而使得在后续TissueLyzer应用期间即使用力移动珠粒其也不会接触(可调整时间和频率以得到所需基质(例如2，5-DHB和CHCA)的最佳均匀覆盖)。 图20描绘显示内部的TissueBox的适配器组固持器。图21描绘TissueLyzer装置，其以所需时间和频率同时震荡两个适配器组以使得球状物通过球磨方法研磨基质。如果如图18中所示放置筛子，那么基质会沉积于组织切片上。在无筛子的情况下，基质/分析物无溶剂制备可如图1-14中所示来进行。图29描绘在布鲁克(Bruker) T0F/T0F仪器上使用2，5-DHB作为基质进行小鼠脑的无溶剂TissueBox制备。上部图像展示组织成像和依质量选择斑点并且在下部图像中展示质谱，据此选择质量来获得m/z 772. 5处信号的MS/MS断裂。结果展示于图30中，其为使用TissueBox制备方法进行组织成像的一个实例。图30展示来自小鼠脑组织的m/z 772. 5Da的无溶剂MALDI T0F/T0F。在86，058m/z、183，991m/z、551，288m/z、713, 371m/z和772，501m/z处可见峰。选择组织斑点的断裂的质谱并从组织材料依质量选择离子m/z 772. 5 (参见图29)。图34描绘对于甚至更细粒径使用双筛网方法的组织盒图。所述设计类似于图18，即单筛网TissueBox，除了使用两个筛网。双筛网方法通常使用两个不同尺寸的筛网；具有较小‘？L’孔隙的筛网位于可保留珠粒的具有较大孔隙的筛网下方。这种中间隔室使晶粒尺寸细化到甚至更小的粒子，从而覆盖下方的表面(本文中说明的是封埋有组织切片的载玻片)。图35描绘双筛网TissueBox方法和具有组织的载玻片的图。图35展示用于组装图34中所描绘的双筛网TissueBox的已制造部分。左边展示具有两种不同‘孔’尺寸的所安装筛网(在这里20μπι的是组装于上部且3μπι的是组装于中间)。其次，右边展示下隔室。最右边展示载玻片(封埋有两个组织切片)，其将会组装于下隔室的下方。可用双筛网方法消除预研磨。图41描绘比较常规RG(上部)与TG(下部)的流程。对于较高动量粒子来说，TG中的向前动量消除了对在样品板与质谱仪的离子入口之间施加电压的需要。图42描绘用于在AP下产生离子的基质涂覆和基于激光的源设计的示意图。图42⑷展示RG且图42⑶展示TG。
图48是两种不同无溶剂样品制备方法的图。流程的上部部分展示无溶剂使用TissueBox方法将基质涂覆于组织上，其通常将与RG MALDI 一起使用。下半部分展示首先使用TissueBox无溶剂方法用基质涂布显微镜载玻片，接着涂覆于组织上。这种方法针对透射几何条件具有优点。在两种情况下，激光能量都是被基质而非组织吸收。图49-52提供用于进行无溶剂MALDI的设备的照片。图49描绘使用LSI形成多电荷离子的实验的结果。展示已使用干液滴方法涂覆基质/分析物的石英板的固持器。氮气激光是黑色盒子并且正好位于其前方的是赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)离子最大源(Ion Max source)。图50从正面描绘离子最大源的特写图，以最显著位置展示固持于x、y、z台上的聚焦透镜。通过透镜聚焦激光束以撞击固持于接近质谱仪离子入口小孔的石英板上的基质/分析物样品。激光束与离子入口毛细管(180度)串联并撞击固持于距离MS离子入口小孔O. 2mm到20mm处的样品。图51还展示石英玻璃上的孔和样品。图52展示通过仅以正向和反向移动使石英板多次穿过激光束而形成穿过基质的线(心形)。图53-61展示使用LSI获得的结果。图53和54展示使用LSI获得的关于鞘磷脂 的结果。图55展示关于2，5-DHB中的磷脂酰甘油(一种脂质)的结果，其在LSI中再次展示单电荷离子，正如ESI中一样。图56展示使用LSI获得的关于磷脂酰肌醇的结果。图57展示使用LSI获得的关于大麻素(anadamide)的结果。图58展示使用LSI获得的关于NAGly的结果。图59展示使用LSI获得的关于亮氨酸脑啡肽(leu_enkaphalin)的结果。图60展示使用LSI获得的关于缓激肽的结果。图61展示使用LSI获得的关于物质P的结果O图64-67展示使用LSI获得的其它结果。图64展示关于ACTH的结果，其电荷状态为+2和+3。图65-67展示关于淀粉样蛋白(1-42)的结果，其电荷状态分别为+4、+5和
+6 ο图69提供用于在电压下进行无溶剂MALDI的设备的照片。图70提供在电压下使用AP穿过阶段MALDI获得的关于血管紧张素I的结果。与在缺少电压的情况下可见电荷状态+2和+3的图62相比，电荷状态为+1和+2。图71-80提供本文所揭示的方法的益处的其它证据。如图71B-C中所示，片段离子提供BSA的胰蛋白酶肽的必需序列信息。具体来说，图71A-C描绘胰蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)蛋白质消化物的LSI-IMS-MS和MS/MS，其使用基于溶剂的样品制备条件和2，5-DHAP基质，150°C的锥孔温度和所安装的脱溶剂化装置(未加热)I) IMS-MS (图71A)、IDTriWave切片的图71 (B)阱和图71 (C)转移区域中的CID断裂。左边显示质谱且右边显示漂移时间分离相对于质荷比(m/z)的2D图。图72A-B描绘总无溶剂分析的益处的实例。由肽和脂质(50/50摩尔比)制备模型混合物并通过以下进行分析1)使用LSI的总无溶剂分析；11)使用无溶剂样品制备的IMS-MS ;仅II检测出两种组分。部分㈧描绘2D IMS-MS图，且部分⑶描绘质谱。图73A-B描绘通过粗油样品的无溶剂样品制备、随后LSI-MS-MS采集进行的TSA。图73(A)描绘质谱且图73(B)描绘在无溶剂条件下在加热(超过200°C )下溶于2，5-DHB中的纯粗油的漂移时间(td)相对于m/z的二维图。图74A-C描绘TSA质谱和漂移时间(td)相对于m/z的二维图图74A展示在无溶剂条件下在30Hz持续5分钟的研磨模式下制备的溶于2，5-DHAP中的粗油，添加其它基质并在30Hz下重复研磨5分钟；图74B展示与图74A相同制备的纯植物油；且图74C展示在30Hz持续5分钟的研磨模式下溶于2，5-DHAP中的机油。对于图74A-C，使用2 μ L分析物且在无溶剂条件下制备。向所有三种样品施加热且根据离子迁移率尺寸的形状分离产生的离子。这一信息显示不存在如传统MALDI分析中常见的激光诱导的聚集体。这些LSI结果还指示与基质有关的化学背景并不明显。虽然纯植物油和机油中存在很多低质量种类，但与粗油样品有关的复杂性可在2D图中观察到。此外，2D图还指示适用于使用瞬象方法比较分析漂移时间相对于m/z的2D图形显示。图75描绘使用2，5-DHB和使用400°C的经加热转移毛细管在LTQ Velos仪器上进行碳酸酐酶(平均分子量29029)蛋白质的LSI。图76描绘在LTQ-ETD Velos仪器上进行LSI。在无停机时间(真空联锁)或交叉污染的情况下快速采集多个样品。图77A-B描绘OVA肽323-339的不同电荷状态的LSI-CID质谱。图77 (A)m/z =887 ;图 77 (B) m/z = 444，使用 DHB 基质。 图78A-F 描绘图 78 (A，D)混合物 I 的 LSI-LTQ-MS 分析和图 78 (B，E) GF (m/z =612.4)的CID谱图的比较。图78(C，F)展示Ang I (m/z = 648. 9)，使用DHAP和DHB基质。图78 (D) DHB产生的电荷状态高于DHAP (图78A)。图78 (B, C，E，F)显示对于两种基质观察到通过CID断裂获得的类似序列信息。图79A-B 描绘使用 OVA 肽 323-339 (m/z 444. 554)的 CID 的 LSI-MSn (η = 2 和 3)谱图。图79 (A)展示LSI-MS2，且图79 (B)展示LSI-MS3，使用DHB。图80Α-Β描绘含有血管紧张素I (Ang. I)、OVA肽323-339 (0VA)、β-淀粉样蛋白10-20 (BA (10-20))、髓鞘蛋白脂质蛋白139-151 (MPP)和生长因子102-111 (GF)的混合物中Ang. I (m/z 433)的MS/MS谱图。图80 (A)展示LSI-CID，且图80 (B)展示LSI-ETD,使用DHB基质。图81A-B描绘经氧化的β -淀粉样蛋白10-20 (BA)的MS/MS谱图，m/z 488 (A)LSI-CID、(B)LSI-ETD，使用DHB。与LSI-CID相比，使用LSI-ETD观察到改进的序列覆盖。图82A-E说明LSI-MS分析的优化和益处⑴利用精确和连续烧蚀，使用SYNAPTG2的XYZ台(左栏)，即手动成像实验设定进行采集，(A)到(C);封埋有基质/分析物样品的载玻片(D)基于溶剂到(E)无溶剂样品制备，使用2，5-DHAP和血管紧张素I。图83A-B描绘基于溶剂沉积且在透射几何条件LSI型设定下通过N2激光烧蚀的
2,5-DHB的显微术；将第二显微载玻片放在距离约2mm处而非质谱仪入口孔以收集经烧蚀的股流左边(a)显示母载片上的烧蚀区域且右边(b)显示收集的股流。实验观察结果显示在激光烧蚀过程中形成“簇”或“液滴”。图101A-C描绘通过电荷远程断裂进行脂肪酸分析。所述图展示在SYNAPT HD质谱仪上使用真空MALDI获得的油酸的TSA。图IOlA描绘质谱，图IOlB描绘二维漂移时间相对于m/z，且图IOlC描绘针对两种同重元素m/z 295. 123到295. 179和m/z295. 260到295. 322所选取的漂移时间。图102描绘通过电荷远程断裂进行脂肪酸分析。图101A-C的油酸MS/MS :部分(A)展示总MS且部分(B)展示观察到三种迁移率。最低迁移率显示电荷远程断裂且因此提供如部分(C. 3)中所见的结构信息(C-9双键位置)。图103描绘用于血管紧张素1(肽)的传统电离方法的总结。左图展示来自真空MALDI的结果并且右图展示AP ESI。图104描绘图103中所示的用于血管紧张素I (肽)的传统电离方法结合LSI (下部)的总结。LSI展示使用含有痕量肽的固体基质(2，5_ 二羟基苯甲酸[2，5-DHB])的激光烧蚀的类似ESI的多电荷离子质谱。图105描绘LSI-MS示意图和结果。上部部分展示LSI方法的示意图，展示激光烧蚀产生多电荷簇或液滴，其进入脱溶剂化区域以蒸发基质，从而释放多电荷离子。左下部分展示相对于似乎通过常规MALDI机制(APCI方法)产生的单电荷离子，多电荷离子增加脱溶剂化区域(右上所示)的温度的反应。右下部分展示收集于与含有基质2，5-DHB的母显微镜载玻片保持3mm距离的显微镜载片上的经激光烧蚀的液滴。条件类似于LSI激光烧蚀条件并显示液滴通过在AP下进行激光烧蚀而由固体基质产生。图106展示LSI仪器的照片。上部部分展示MS-MS SYNAPT G2。已去除双喷针电喷雾离子源(Iockspray)的马达以提供将激光(右上)直接与质谱仪的孔对准的能力。激光与孔之间的聚焦透镜允许激光束直接聚焦于放在载玻片上且封埋于孔前I到3mm处的基 质/分析物样品上。右下部分展示源修改的内部视图。样品面向热装置(白色)，激光从背面(这里是右侧)击中；使用纳米电喷雾源的xyz台移动(光栅)基质/分析物样品穿过聚焦的激光束。前面的电线可接通例如自耦变压器装置(Variac device)，也可以提供热，这视所用的基质而定。左下部分展示载有约3打LSI样品的显微载玻片。图107A-B描绘使用2，5-DHB作为基质时牛胰岛素的LSI-MS-MS。图107A描绘当施加热并使样品移动穿过聚焦的激光束时，总离子流提供有效离子产生的指示。采集约80秒后，关闭温度，观察到一大滴离子流。图107B描绘来自总离子流的多次采集的质谱。如电荷状态+4的插图谱图所示，在高分辨率下展示使用ESI通常观察到的丰富信号和电荷状态。图108描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时溶菌酶与泛素的较低丰度蛋白质混合物的LSI-IMS-MS。由于这两种蛋白质的电荷状态褶合而观察到拥挤的总质谱。图109描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时，在与图108类似的浓度下泛素的二维漂移时间相对于m/z。如关于ESI离子的情况，根据电荷数和横截面(尺寸和形状)分离LSI离子。图110描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时，在与图108类似的浓度下溶菌酶的二维漂移时间相对于m/z。如关于ESI离子的情况，根据电荷数和横截面(尺寸和形状)分离LSI离子。图111描绘使用2，5-DHB作为基质以及使用经加热的热装置(这里为约5V)时，在与图108相同的浓度下泛素和溶菌酶的二维漂移时间相对于m/z。如关于ESI离子的情况，根据电荷数和横截面(尺寸和形状)分离两种蛋白质的LSI离子。数据的二维性和图形显示允许指定两种蛋白质和电荷状态的各特点的身份。如图112中关于溶菌酶所示，可清楚地选取各蛋白质的质谱。图112A-B描绘泛素和溶菌酶的MS。图112A描绘如图108中所示的泛素和溶菌酶的总MS。图112B描绘从图111中所示的2维漂移时间相对于m/z图选取的溶菌酶的质
-i'TfeP曰。
图113描绘使用2，5-DHB在不施加热的情况下粗油的LSI-MS-MS分析。图114描绘使用2，5-DHB在施加热的情况下粗油的LSI-MS-MS分析。当认为‘不对脱溶剂化装置施加热’时，其仍连接于150°C的离子源分离器。因此，金属脱溶剂化装置接近150°C。当对脱溶剂化装置施加热时，其加热到超过150°C。当施加热时，观察到更丰富且更高分子量的离子。在气相下分离离子。未观察到由高激光功率引起的聚集，这在使用激光解吸/电离时通常观察到或在使用ESI时观察到较高浓度。这些复杂系统的图形瞬象可具有足够特殊性以进行快速区分，只要使用相同样品和采集方案即可。图115A-D描绘使用2，5-DHAP和脱溶剂化装置在不施加热的情况下分子量递增的蛋白质的LSI-IMS-MS。图115A展示关于牛胰岛素的结果，图115B展示关于泛素的结果，图115C展示关于细胞色素C的结果，且图IlOT展示关于溶菌酶的结果。图116描绘用于分析异构蛋白质混合物的LSI-MS-MS，所述混合物由于m/z相同且如这里所示电荷状态分布极其相似而不可能仅通过质谱法来区分。β淀粉样蛋白(1-42)的总质谱展示于部分(A)中且淀粉样蛋白(42-1)展示于部分(B)中。使用2，5_DHAP 作为基质进行分析并且不对脱溶剂化装置施加热。图117描绘β淀粉样蛋白(1-42)的二维漂移时间相对于m/z。二维漂移时间相对于m/z展示根据电荷数和横截面进行分离。使用2，5-DHAP作为基质进行分析并且不对热装置施加热。图118描绘淀粉样蛋白(42-1)的二维漂移时间相对于m/z。二维漂移时间相对于m/z展示根据电荷数和横截面进行分离。使用2，5-DHAP作为基质进行分析并且不对热装置施加热。本文所揭示的方法展示分析物/基质簇的脱溶剂化可通过增加温度(2，5-DBH,约4000C )和通过降低基质的热要求(2，5-DHB，约300°C )来实现。本文所揭示的方法还展示异构蛋白质混合物的电荷状态家族是以MS尺寸来进行基线分离。图119-122描绘与通过ESI在SYNAPT G2上使用相同纳米电喷雾电离源获得的结果相比，基于通过LSI获得的漂移时间结果的泛素结构。图119描绘用于使用泛素比较ESI-IMS-MS与LSI-MS-MS的条件。图120描绘以2维漂移时间相对于m/z图显示的泛素的LSI-MS-MS结果。图121描绘以2维漂移时间相对于m/z图显示的泛素的ESI-MS-MS结果。LSI和ESI的电荷状态极相似，ESI离子的离子丰度较高。图122描绘针对图120和121的所有电荷状态所选取的漂移时间分布。左边显示LSI离子且右边显示ESI离子。LSI和ESI离子显示基本上相同的漂移时间。与电荷状态无关，与各别ESI离子相比，LSI离子具有较窄漂移时间。此外，与ESI离子+12相比，具有电荷状态+12的LSI离子显示分辨率更高的漂移时间分布。因此，LSI提供大分子的软电离并保留结构信息。图123-127描绘基于通过LSI获得的漂移时间结果的泛素结构。图123描绘用于图124-127中所示的结果的条件。LSI条件与图199中的相同，然而，锥孔电压从OV(传统LSI条件)系统地变成100V (典型ESI值)。图124描绘在递增锥孔电压下获得的MS，显示离子丰度增加和较低电荷状态(电荷剥离)。选取针对电荷状态+9、+7、+5的漂移时间分布。图125描绘从图124选取的针对电荷状态+9的漂移时间。电荷状态+9显示窄的漂移时间分布。在100V锥孔电压下，也观察到较长漂移时间(大致为80漂移时间箱(drifttime bin))，表示一些蛋白质离子通过打开变成更长的结构而损失其结构。图126描绘从图124选取的针对电荷状态+7的漂移时间。电荷状态+7显示多个漂移时间(大致< 95箱)，表示在OV锥孔电压下的多种紧密结构。在电压递增的情况下，这些漂移时间消失且仅观察到一个丰富的漂移时间。图127描绘从图124选取的针对电荷状态+5的漂移时间。电荷状态+5显示广泛的漂移时间分布。在电压递增的情况下，分布的丰度变得更充分。这些结果显示在OV锥孔电压下，应用在递增电压下损失的多种结构。因此，LSI是保持泛素结构完整性的软电离方法。图128描绘与蛋白质(左图)相比蛋白质复合物(右图)的LSI-MS-MS漂移时间分布。对于所有电荷状态都观察到较长漂移时间，电荷状态+7最显著。这一观察结果与蛋白质-配体复合物的较大横截面一致。本文所揭示的方法显示使用相同纳米ESI-MS-MS仪器，LSI与ESI对于所有电荷状态都显示类似漂移时间，其中LSI显示较少构象。本文所揭示的方法关于LSI和锥孔电 压还显示，电压增加较低电荷状态离子(电荷剥离)的丰度，电压引入背景且在电压递增的情况下观察到较少构象。 图129描绘牛胰岛素的TSA。使用2，5-DHAP基质/牛胰岛素的TissueLyzer均质化/转移和脱溶剂化装置在不施加热的情况下进行分析。形成多电荷离子并且在气相下分离，如在2维漂移时间相对于m/z图中所观察到的。图130描绘血管紧张素I的TSA。使用不同基质/血管紧张素I的TissueLyzer均质化/转移和脱溶剂化装置在不施加热的情况下进行分析。形成多电荷离子并且在气相下分离，如所选取的漂移时间分布中所示。展示漂移时间的上部展示在负离子模式下测量的2-氨基苯甲醇，展示漂移时间的中间部分展示在正离子模式下测量的2-氨基苯甲醇并且展示漂移时间的下部展示在正离子模式下测量的2，5-DHAP。结果显示在负离子和正离子模式下TSA可使用各种不同基质。与经质子化的离子相比，相同电荷状态的负离子(双电荷)具有较快漂移时间。由两种不同基质产生的双正电荷离子具有基本上相同的漂移时间，表示基质对离子的漂移时间(因此对结构)具有极小影响。应注意，ABA的基于溶剂的样品制备不允许产生双负电荷离子；当使用Nd/YAG激光(355nm)时，观察到双负电荷离子。图131-132展示脂质(鞘磷脂，SM)与肽(血管紧张素l，Ang. I)以I : I摩尔比存在的确定混合物的分析。图131描绘脂质(鞘磷脂，SM)与肽(血管紧张素l，Ang. I)以II摩尔比存在的确定混合物的基于溶剂的分析。图132描绘脂质(鞘磷脂，SM)与肽(血管紧张素l，Ang. I)以I : I摩尔比存在的确定混合物的TSA分析。图131仅观察到肽，而图132观察到混合物的两种组分，即SM和Ang. I。这些结果显示分析的定性和相对定量改进。使用2，5-DHAP基质/分析物混合物的TissueLyzer均质化/转移和脱溶剂化装置在不施加热的情况下进行所述分析。形成多电荷离子并且在气相下分离，如在2维漂移时间相对于m/z图中所观察到的。除非另有指示，否则说明书和权利要求书中所用的表示成分的数量、诸如分子量等性质、反应条件等的所有数字在所有情况下都应理解为由术语“约”修饰。因此，除非与此相反地指出，否则说明书和随附权利要求书中所述的数值参数为近似值，其可视本发明设法获得的所需性质而变化。最低限度地且不试图限制将同等原则应用于权利要求书的范围，各数值参数应至少根据所报导的有效位的数字并藉由应用一般舍入技术来理解。尽管阐述本发明的宽广范围的数值范围和参数为近似值，但特定实例中所述的数值应尽可能精确地报导。然而，任何数值都固有地含有由其各别测试测量结果中所发现的标准偏差必然产生的某些误差。除非本文中另有指示或明显同上下文矛盾，否则在描述本发明的情况下(尤其在以下权利要求书的情况下)所用的术语“一”、“所述”和类似指示物应理解为涵盖单数与复数。本文中对数值范围的叙述仅打算用作个别地提及属于所述范围内的各个值的简写方法。除非本文中另有指示，否则各个值并入说明书中，就如同其个别地在本文中叙述一样。除非本文中另有指示或者明显同上下文矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何合适的次序进行。本文所提供的任何和所有实例或示 范性语言(例如“诸如”)的使用仅打算较好地阐明本发明且不对另外主张的本发明的范围施加限制。说明书中的措辞不应理解为指示对本发明的实践为必需的任何未主张的要素。本文所揭示的本发明的替代性要素或实施例的群组不应理解为具有限制。各群组成员可个别地或以与群组的其它成员或本文所见的其它要素的任何组合形式提及和主张。预期出于便利性和/或专利性的原因，群组的一个或一个以上成员可包括在群组内或从群组内删去。当存在任何所述包括或删去时，认为说明书含有经修改的群组，由此满足随附权利要求书中所用的所有库西群组(Markush group)的书面描述。本文描述本发明的某些实施例，包括发明者已知用于进行本发明的最佳方式。当然，这些所述实施例的变化对于所属领域的技术人员在阅读以上描述后将变得显而易见。本发明者预期所属领域的技术人员视情况使用所述变化，并且本发明者打算以除本文具体所述外的方式实践本发明。因此，本发明包括如适用法律所允许的随附权利要求书中所述的标的物的所有修改和同等物。另外，除非本文中另有指示或者明显同上下文矛盾，否则本发明涵盖呈所有可能变化形式的上述要素的任何组合。本文所揭示的特定实施例可进一步使用由……组成或和基本上由……组成的措辞在权利要求书中加以限制。当用于权利要求书中时，无论如所申请或根据修正添加的，过渡术语“由……组成”不包括权利要求书中未规定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”对指定物质或步骤和不显著影响基本和新颖特征的那些物质限制权利要求的范围。本文中自然地或明确地描述如此主张的本发明的实施例并进行实施。最后，应了解本文所揭示的本发明的实施例说明本发明的原理。可使用的其它修改也在本发明的范围内。因此，举例来说(但不限于)，可根据本文中的教示使用本发明的替代性配置。因此，本发明并不限于如图明确所示和所述的内容。
权利要求
1.一种产生多电荷离子以用于分析材料的方法,其包含 a.将所述材料和基质涂覆于表面作为材料/基质分析物； b.在大气压或接近大气压下用激光烧蚀所述材料/基质分析物；和 c.使所述经激光烧蚀的材料/基质分析物穿过加热区域,随后所述材料/基质分析物进入质谱仪的高度真空区域。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述基质由在所述激光的波长下吸收能量的小分子构成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述小分子是选自由以下组成的群组二羟基苯甲酸、2，5_ 二羟基苯甲酸(2，5-DHB) ; 二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮(2，5-DHAP)、2，6-二羟基苯乙酮(2，6-DHAP)、2，4，6-三羟基苯乙酮(2，4，6-THAP)、a -氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、2-氨基苯甲醇(2-ABA)和其组合。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述激光在紫外区中具有输出。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述激光是氮气激光(337nm)或三倍频Nd/YAG激光(355nm)。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述加热区域是加热管。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述管由不会放出对所述质谱仪真空系统有害的蒸气的耐热材料构成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述管由金属或石英构成。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述管加热到介于50°C到600°C之间的温度。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述管加热到介于150°C到450°C之间的温度。
11.根据权利要求I所述的方法，其中由所述材料/基质分析物的激光烧蚀点和通向所述质谱仪的真空的离子入口界定的离子源区域中的电场小于800V。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述离子源区域中的所述电场小于100V。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述离子源区域中的所述电场是OV或小于0V。
14.根据权利要求I所述的方法，其中所述材料是生物材料或非生物材料。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述材料是选自由蛋白质、肽、碳水化合物和脂质组成的群组的生物材料。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述材料是选自由聚合物和油组成的群组的非生物材料。
17.根据权利要求I所述的方法，其进一步包含使用无溶剂材料/基质分析物制备方法分析所述材料/基质分析物。
18.根据权利要求18所述的方法，其中所述分析包括表面成像和/或电荷远程断裂以用于结构表征。
19.根据权利要求I所述的方法，其中使用质谱仪用于分析所述材料/基质分析物。
20.一种用于进行根据权利要求I所述的方法的系统。
全文摘要
本文揭示用于使用激光喷雾电离(laserspray ionization，LSI)的质谱法的系统和方法。LSI可在大气压下产生多电荷离子以用于分析并且允许分析高分子量分子，包括超过4000道尔顿(Dalton)的分子。所述分析可以是基于溶剂或无溶剂分析。在LSI之后进行无溶剂分析允许改进的空间分辨率，其有利于表面和/或组织成像。
文档编号H01J27/24GK102741965SQ201080024695
公开日2012年10月17日 申请日期2010年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者萨拉·特林平 申请人:韦恩州立大学