中性解吸-电喷雾萃取电离质谱法快速检测蜂蜜中毒死蜱的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于检测技术领域，特别涉及蜂蜜中毒死蜱的检测方法。
【背景技术】
[0002]毒死蜱是一种广泛使用的高效广谱有机磷农药，既可以杀螨，又可做卫生除虫药，主要用于蔬菜果树、棉花等多种作物的病虫害防治，但对蜜源植物的威胁较大。毒理学研宄表明，毒死蜱具有显著抑制胆碱酯酶活性的作用，对小鼠的中枢神经系统产生毒害，并具有一定的致畸作用。蜂蜜中有机磷农药残留的分析研宄表明，毒死蜱在蜂蜜中的残留超标现象普遍存在。中国是世界第一养蜂大国，也是蜂产品生产和出口大国。随着人民生活水平的提高以及进出口贸易的快速发展，蜂蜜中的毒死蜱残留已经成为影响我国蜂蜜出口的首要因素，严重危害国民食品安全及经济的发展。
[0003]目前，常用的毒死蜱检测方法有酶联免疫分析法、高效液相色谱法、液质联用法、气质联用法等。这些方法一般都需要复杂的样品预处理过程，具有操作步骤繁琐、费时等缺陷，给蜂蜜中毒死蜱的检测带来许多不便。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种新的对蜂蜜中毒死蜱残留直接检测的方法。本发明在无需样品预处理的条件下，对蜂蜜中的毒死蜱直接进行快速检测。本发明采用毒死蜱的三级串联碎片进行定量分析，避免假阳性，提高检测的准确性。
[0005]本发明所述的检测方法是借助常规的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪和中性解吸-电喷雾萃取电离(neutral desorpt1n-extractive electrospray 1nizat1n massspectrometry, ND-EESI)源进行含毒死蜱蜂蜜样品的检测。
[0006]本发明技术方案如下:
[0007]一种中性解吸-电喷雾萃取电离质谱直接检测蜂蜜中毒死蜱的方法，包括如下步骤:
[0008](I)加标蜂蜜配制:称取待测样品蜂蜜，待用；
[0009]加标蜂蜜配制:平行几份称取与待测样品蜂蜜等重的无毒死蜱蜂蜜，分别加入梯度浓度的毒死蜱溶液，搅拌均匀，成加标蜂蜜，待用；
[0010]将待测样品蜂蜜及加标蜂蜜均用保鲜膜封口 65°C水浴5min ;待蜂蜜冷却到室温，进行检测；
[0011](2)中性解吸一电喷雾萃取电离质谱检测:将ND-EES1-MS设置为正离子检测模式，质谱检测扫描范围为m/z 50?400 ；以甲醇水溶液为中性解吸试剂；电离电压3.5kV ；离子传输管温度为300°C ;雾化气为氮气，压力为1.0MPa;萃取剂甲酸:甲醇:水体积比1:2:2，流速为 4 μ L/min ；
[0012]碰撞诱导解离实验时，毒死蜱母离子m/z 352宽度设置为1.2Da，碰撞能量30%，碰撞持续时间为30ms ;二级m/z 324离子宽度设置为1.4Da，碰撞能量为15%，碰撞持续时间为30ms，以三级m/z 296作为定量离子；
[0013]其它参数采用LTQ-MS系统自动优化；喷雾溶剂通道与水平面夹角为30°，溶剂喷雾口与质谱口距离为0.5cm ;为保证样品分子最大限度与试剂离子进行碰撞并发生反应，两喷雾通道夹角保持60°，样品喷雾口与质谱入口距离为0.5cm ；
[0014](3)是否含有毒死蜱的判断:如果在m/z 352的三级碎片中有m/z 296离子信号峰，说明样品中有毒死蜱；
[0015]选择m/z 352的三级特征碎片离子m/z 296进行定量分析，以加标蜂蜜中毒死蜱浓度为横坐标，以m/z 296的绝对信号强度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线得出待测样品蜂蜜中毒死蜱的浓度。
[0016]本发明的有益效果是:(I)检出限更低，对蜂蜜中毒死蜱的检出限为1.64ng/mL。(2)采用三级信号作为定量信号，避免了假阳性。(3)本发明方法采用甲酸:甲醇:水(1:2:2)喷雾进行中性解吸，解吸效率高，提高了目标信号的强度。(4)实现了蜂蜜的原位分析，无需对样品进行预处理。(5)使实现直接快速的蜂蜜污染物检测技术的应用成为可能，为蜂蜜产业的可持续发展奠定基础。
【附图说明】
[0017]图1为本发明方法的ND-EESI实验装置图。
[0018]图2为本发明毒死蜱(100ng/mL)的MSn谱图，图中，(a)为毒死蜱甲醇溶液一级质谱图，(b)为毒死蜱甲醇溶液串联质谱图，(c)为加标蜂蜜毒死蜱一级质谱图，(d)为加标蜂蜜毒死蜱串联质谱图。
[0019]图3为本发明喷雾试剂优化实验中m/z 296 CID信号强度随电喷雾萃取剂的变化趋势图，图中(I)为不同有机溶剂作为萃取剂，(2)为不同浓度甲酸甲醇溶液作为萃取剂，
(3)A-D分别为20%甲酸+80%甲醇；20%甲酸+40%甲醇+40%丙酮；20%甲酸+40%甲醇+40%乙酸乙酯；20%甲酸+40%甲醇+40%水。
[0020]图4为本发明不同中性解吸剂下的m/z 296信号强度图。
[0021]图5为本发明中影响毒死蜱质谱行为条件的优化图，图中，(a)为电喷雾电压的优化图，(b)为萃取剂流速的优化图，(C)为雾化气压力的优化图，(d)为解吸气压的优化图，(e)为离子传输管温度的优化图。
[0022]图6为不同浓度加标蜂蜜的工作曲线。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明。
[0024]本发明所述的实例使用的质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ — XL型线性离子阱质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的XCalibur数据处理系统。
[0025]中性解吸装置和EESI离子源，由江西省质谱科学与仪器重点实验室自行研制；精密电子天平(METTLERT0LED0)。甲醇(色谱纯，SKCHEM工以LS);毒死蜱标准品(纯度为99%，阿拉丁试剂公司);本发明所述的实例使用的质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统。
[0026]实施例1
[0027]本实验使用图1所示的ND-EES1-MS方法对毒死蜱蜂蜜溶液(100ng/mL)进行实验，
[0028](I)毒死蜱标准溶液:准确称量适量毒死蜱标准品，溶解在甲醇中，配成浓度为2mg/mL的毒死蜱标准溶液，于_3°C避光保存。取100 μ L 2mg/mL毒死蜱标准溶液，用超纯水稀释至4mL，浓度为50 μ g/mL。
[0029](2)加标蜂蜜毒死蜱溶液:量筒置于分析天平，去皮归零，用量筒准确量取9.9mL蜂蜜，称重，为13.96232g。而后分别将各1mL锥形瓶置于分析天平，去皮归零，分别称取13.96g蜂蜜。称量后用保鲜膜封口65°0水浴51^11，量取100 4 1^ 50 μ g/mL稀释液于各盛有蜂蜜的锥形瓶中，搅拌均匀。待蜂蜜冷却到室温，进行质谱检测。
[0030]结果如图2所示，毒死蜱在ND-EESI离子源，正离子模式下，m/z 352毒死蜱[C9H11Cl3NO3PS]+串联质谱分析时，碎片离子有m/z 324,m/z 296,m/z 278。它们分别为m/z352 失去 I 个(-C2H5)，2 个(-C2H5)，2 个(-C2H5)和一份子1120。再对m/z 324, m/z 296 做 CID,进一步确认以上断裂碎片，均与文献中的特征碎片一致。为确保实验可靠性，采用EES1-MS对100ng/mL毒死蜱标准溶液进行了 MS/MS质谱对照分析，结果表明，毒死蜱ND-EES1-MSn谱图与其EES1-MS1^t图完全吻合。因此，如果在实际样品中能检测到信号峰m/z 352，并在MS/MS谱图中观察到主要特征离子m/z 324和m/z 296，则可以判断该样品中含有毒死蜱。
[0031]为排除检测时的假阳性，采用三级特征碎片离子峰m/z 296为目标信号，为提高其信号强度，本实验进行了喷雾试剂的优化，以lOOng/mL的毒死蜱加标蜂蜜为实验对象，以三级质谱信号m/z 296的响应强度为标准，进行水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙醇、丁醇、苯和对二甲苯、乙腈和丙酮的优化实验，如图3(1)所示。经过大量摸索，采用不同甲酸体积分数的甲醇作为萃取剂下毒死蜱三级特征离子m/z 296信号强度，发现加酸具有非常好的效果，结果如图3(2)所示，显示在20%甲酸甲醇溶液作为喷雾试剂，蜂蜜中毒死蜱的三级特征碎片m/z 296信号强度最强，但质谱仪器能允许的最大酸浓度为20%，为此不能再增大酸浓度。为探索更好的喷雾试剂，采用20%甲酸+80%甲醇；20%甲酸+40%甲醇+40%丙酮；20%甲酸+40%甲醇+40%乙酸乙酯；20%甲酸+40%甲醇+40%水作为电喷雾试剂，结果显示，20%甲酸+40%甲醇+40%水效果最好，如图3(3)。因此